人偏肺病毒入胞機制的研究.pdf

1、人偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV）是引起嬰幼兒呼吸系統(tǒng)感染的重要病原體，主要引起嬰幼兒上、下呼吸道感染。雖然目前研究認(rèn)為副黏病毒科病毒通過與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合啟動入胞，但是 hMP V的具體入胞途徑并不是很清楚。病毒進入宿主細(xì)胞的方式主要有兩種：膜融合和胞吞。本課題組首先對 hMP V是以膜融合還是胞吞入胞進行了研究。通過間接免疫熒光、R18融合實驗、R18/DiO C雙波長成像實驗證明了hMP V在進入

2、Vero E6細(xì)胞時存在胞吞的入胞方式。胞吞需要經(jīng)歷一系列復(fù)雜的過程，而脂筏（lipid raft）廣泛的存在于細(xì)胞膜表面，因此本課題組對 hMP V胞吞過程中是否有脂筏的參與進行了研究。通過對 hMP V入胞過程的形態(tài)學(xué)研究、化學(xué)阻斷劑處理等方面證明了脂筏參與了 hMP V的入胞過程并在入胞過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　第一部分：人偏肺病毒以胞吞方式入胞的研究
　　目的：探究hMP V在Vero E6細(xì)胞中的入胞方式，通過

3、對其入胞機制的研究尋找出一種有效的阻斷hMP V感染的的手段。
　　方法：首先將100μl hMPV（MOI=10）接種到Vero E6細(xì)胞，分別在感染后的0 min、30 min、60 min、120 min洗去游離的hMPV并固定細(xì)胞；用帶綠色熒光的抗體標(biāo)記病毒包膜的融合蛋白（F蛋白），用帶紅色熒光的抗體標(biāo)記位于胞核的核心蛋白（N蛋白），通過激光共聚焦顯微鏡觀察在感染后0 min、30 min、60 min、120 min時進

4、入Vero E6細(xì)胞的 hMP V數(shù)量及其在細(xì)胞中所處的位置。然后用R18染料對hMP V包膜染色，用染色后的hMP V感染Vero E6細(xì)胞并用激光共聚焦顯微鏡實時拍攝4 h以觀察hMP V在Vero E6細(xì)胞胞質(zhì)中是否有膜融合的發(fā)生。最后用DiO C和R18兩種染料對hMP V包膜染色，用染色后的hMP V感染Vero E6細(xì)胞并用激光共聚焦顯微鏡實時拍攝2 h以觀察hMP V在Vero E6細(xì)胞發(fā)生膜融合的位置。
　　結(jié)果：

5、熒光抗體對hMP V F蛋白和N蛋白進行標(biāo)記后發(fā)現(xiàn)，在不同的時間點均能觀察到在Vero E6細(xì)胞中F蛋白和N蛋白存在共定位并且隨著時間的增加共定位點數(shù)量也逐漸增加。此結(jié)果表明 hMP V在進入Vero E6細(xì)胞時可以保持病毒顆粒結(jié)構(gòu)的完整。R18融合實驗觀察到細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光并且隨著時間的增加紅色熒光逐漸增多，說明hMP V在入胞過程中發(fā)生膜融合。DiO C/R18融合實驗中整個過程均有紅色熒光出現(xiàn)并逐漸向胞質(zhì)內(nèi)移動，而綠色熒光比紅色熒

6、光出現(xiàn)晚，黃色熒光在30 min以后出現(xiàn)一個急劇上升的過程，說明在30 min后hMP V包膜與細(xì)胞膜發(fā)生膜融合并且膜融合發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。
　　結(jié)論：本實驗證明了hMP V存在胞吞的方式進入Vero E6細(xì)胞，在實驗過程中，首先用間接免疫熒光證明了 hMP V可以完整的進入細(xì)胞；然后用R18融合實驗證明了hMP V在進入細(xì)胞時與細(xì)胞膜發(fā)生了膜融合；最后用R18/DiO C融合實驗證明了hMP V入胞30 min時發(fā)生膜融合并且膜融

7、合發(fā)生的部位在胞質(zhì)內(nèi)，這些實驗均證實了 hMP V存在胞吞的方式進入Vero E6細(xì)胞。
　　第二部分：脂筏在人偏肺病毒感染宿主細(xì)胞中的作用機制研究
　　目的：探究脂筏是否參與了人偏肺病毒入胞的過程，通過對脂筏的研究進一步了解hMP V入胞過程。
　　方法：hMPV接種病毒后在培養(yǎng)基中加入霍亂毒素亞單位（CTB）同時作用6HBE細(xì)胞，分別在感染后的0 min、30 min、60 min、120 min固定細(xì)胞，用帶紅色

8、熒光的抗體標(biāo)記hMP V融合蛋白（F蛋白），激光共聚焦顯微鏡觀察CT B與hMP V在不同時間點的位置關(guān)系；分別用1 mg/ml、5 mg/ml、7.5 mg/ml MβCD和10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml Nystatin處理16HBE細(xì)胞后感染hMPV，感染24 h后用熒光定量PCR檢測不同處理組hMP V滴度。將50μg/m l、100μg/ml外源性膽固醇加入5 mg/m l MβC D處理后的16HBE細(xì)胞，接

9、毒后24 h用熒光定量P CR檢測hMP V滴度。
　　結(jié)果：hMP V在進入宿主細(xì)胞時與脂筏標(biāo)記物霍亂毒素亞單位存在共定位，并且隨著時間的增加，共定位點逐漸增加；hMP V伴隨著CTB逐漸向胞核方向移。MβCD處理后，隨著藥物濃度的逐漸升高h(yuǎn)MP V滴度分別降低了81%、90%和98%； Nys tatin處理后，隨著藥物濃度的逐漸升高h(yuǎn)MP V滴度分別降低了44%、63%和89%。向5 mg/m l MβC D處理后的16HB

10、E細(xì)胞中加入外源性膽固醇，當(dāng)膽固醇濃度達到100μg/m l時，hMP V感染顯著升高；添加外源性膽固醇后hMP V滴度時藥物處理組的4倍。
　　結(jié)論：本實驗證明了脂筏參與了人偏肺病毒胞吞過程并在胞吞過程中發(fā)揮重要作用。首先用CTB來標(biāo)記脂筏，通過CTB來觀察不同時間點脂筏與hMPV位置關(guān)系；然后用了MβCD、Nystatin兩種破壞脂筏的藥物處理細(xì)胞來檢測脂筏破壞對 hMP V感染的影響；最后通過外源性膽固醇補救檢測添加外源性膽