缺氧對誘導多功能干細胞生物學功能的影響.pdf

1、誘導多功能干細胞（iPS），具有和胚胎干細胞類似的發(fā)育多潛能性，由于其避開了胚胎干細胞研究面臨的倫理和法律等問題，在生物學和醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景。目前有關缺氧/低氧對iPS細胞的生物學功能的影響尚不清楚。iPS對腎缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)有否治療作用，目前尚無報道。
　　目的：本工作擬在iPS細胞，研究缺氧對iPS細胞的增值、遷移、黏附、凋亡以及基因表達等的影響；進而用

2、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）siRNA轉染 iPS細胞，觀察降低HIF-1α表達后，缺氧對iPS細胞作用的影響；建立小鼠急性腎缺血模型，觀察iPS細胞是否對腎缺血再灌注損傷有保護作用。
　　方法：應用逆轉錄病毒載體向原代培養(yǎng)的MEF細胞導入Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc四種基因，誘導出iPS細胞。iPS細胞實驗分為四組：①常氧（Normoxia）組、②缺氧（Hypoxia）組、③缺氧+轉染隨機序列siRNA（Hyp

3、oxia+con siRNA）組、④缺氧+轉染HIF-1a siRNA（Hypoxia+HIF-1a siRNA）組，向③④組iPS細胞分別轉染con siRNA和HIF-1a siRNA，然后將②③④同時置缺氧盒里缺氧處理12小時，應用real-time PCR、流式細胞儀等技術檢測各組iPS細胞的基因表達、凋亡、增殖、遷移、粘附等情況。動物實驗：建立腎缺血再灌注模型，采用摘除右腎，左腎動靜脈扎閉50分鐘的方法，分別向各組左腎包膜內注

4、射以下不同處理過的iPS細胞:常氧iPS細胞、低氧處理iPS細胞、低氧+con siRNA iPS細胞、低氧+HIF-1a siRNA iPS細胞和PBS，觀察上述iPS細胞干預對腎缺血再灌注損傷的影響。
　　結果：1缺氧及HIF-1a對 iPS細胞增殖的影響：與常氧組（1±0）相比，Hypoxia組（0.86±0.04）iPS細胞數(shù)明顯下降，下降至缺氧前的86±4％，P<0.05；與陰性對照Hypoxia+con siRNA組(

5、0.87±0.03)相比，Hypoxia+HIF-1 a siRNA組(0.77±0.02)iPS細胞數(shù)明顯下降，P<0.05。以上結果表明缺氧可抑制iPS細胞增殖，降低HIF-1 a表達加重缺氧對iPS細胞增殖的抑制作用。2缺氧及HIF-1a對iPS細胞遷移的影響：與常氧組（1±0）相比，Hypoxia組遷移細胞數(shù)比常氧組明顯增多,為3.96±0.84,P<0.05；Hypoxia+HIF-1 a siRNA組為1.22±0.04,比

6、Hypoxia+con siRNA組（4.12±1.11）明顯減少，P<0.05,表明缺氧促進iPS細胞遷移，降低HIF-1 a表達可抑制缺氧對iPS細胞遷移的促進作用。3缺氧及HIF-1a對 iPS細胞穿內皮遷移的影響：與常氧組1±0相比， Hypoxia組穿內皮遷移的iPS細胞數(shù)明顯減少，為0.56±0.10，P<0.05；與Hypoxia+con siRNA（0.70±0.19）相比，Hypoxia+HIF-1 a siRNA組上

7、升為1.19±0.19，P<0.05，有統(tǒng)計學差異；表明缺氧抑制iPS細胞穿內皮遷移，降低HIF-1 a表達可抑制缺氧對iPS細胞穿內皮遷移的作用。4缺氧及HIF-1a對iPS細胞黏附的影響：常氧組為1±0，與其相比Hypoxia組降低為0.60±0.09，P<0.05，有統(tǒng)計學差異；Hypoxia+con siRNA組為0.75±0.10，與其相比Hypoxia+HIF-1 a siRNA組上升為1.41±0.15，P<0.05，有統(tǒng)

8、計學差異；說明缺氧抑制iPS細胞粘附，降低HIF-1 a表達可減弱缺氧抑制iPS細胞的粘附作用。5缺氧及HIF-1a對iPS細胞與內皮細胞黏附的影響：常氧組iPS細胞與內皮細胞粘附經(jīng)標準化處理為1±0，Hypoxia組為0.73±0.10，與常氧組相比Hypoxia組明顯下降，P<0.05，有統(tǒng)計學差異；Hypoxia+con siRNA組為0.82±0.08，與其相比Hypoxia+HIF-1 a siRNA組上升為1.20±0.16

9、，P<0.05；以上結果表明，缺氧抑制iPS細胞與內皮細胞的粘附，降低HIF-1 a表達可減弱缺氧抑制iPS粘附的作用。6缺氧及HIF-1a對iPS細胞凋亡的影響：常氧組早期凋亡為11.28±1.34，與常氧組相比Hypoxia組上升為14.23±2.98，P≥0.05，沒有統(tǒng)計學差異；Hypoxia+con siRNA組為19.95±4.22，與其相比，Hypoxia+HIF-1 a siRNA組降低為16.22±1.44，P≥0.0

10、5，沒有統(tǒng)計學差異。常氧組晚期凋亡為5.35±1.09，Hypoxia組上升為6.63±0.14，與常氧組相比P≥0.05，沒有統(tǒng)計學差異；Hypoxia+con siRNA組為16.18±1.19，與其相比，Hypoxia+HIF-1 a siRNA組降低為14.26±0.62，P<0.05，有統(tǒng)計學差異。以上結果表明缺氧對iPS細胞早期凋亡和晚期凋亡沒有顯著作用；但降低HIF-1 a，可在一定程度上抑制晚期凋亡。7缺氧處理iPS細胞

11、12小時，SOD1、FGFR2、CCS、TEK、PLAU、NME4、MTA2基因的RNA表達明顯下降，降低iPS細胞HIF-1a表達可抑制缺氧對iPS細胞上述基因的作用。8缺氧及HIF-1a對iPS細胞在缺血再灌腎臟中遷移的影響：與正常iPS組（1±0）相比， Hypoxia組（1.56±0.33）iPS細胞在損傷腎臟中遷移距離明顯增長，且P<0.05；與Hypoxia+con siRNA組（1.37±0.21）相比 Hypoxia+H

12、IF-1a siRNA組（0.6±0.21）iPS細胞在缺血再灌注腎臟中的遷移距離明顯縮短，且P<0.05，這與上文中iPS細胞體外遷移實驗結果是一致的。9 iPS細胞對缺血再灌注損傷腎臟腎功能的影響：與PBS組（134.95±16.75）相比，正常iPS組（216.66±27.87）小鼠血清肌苷升高；與正常iPS組（216.66±27.87）相比，Hypoxia組血清肌苷下降明顯，為40.21±40.58，P<0.05，有統(tǒng)計學差異；

13、與Hypoxia+con siRNA組（112.64±29.81）相比，Hypoxia+HIF-1 a siRNA組血清肌苷值有明顯上升，為153.71±25.26。以上結果表明：腎包膜下注射缺氧處理的iPS細胞，可降低缺血再灌注損傷腎臟小鼠的血清肌苷值；降低缺氧iPS細胞HIF-1 a表達可抑制缺氧iPS細胞降低肌苷值的作用。
　　結論：1．缺氧處理12小時可抑制iPS細胞增殖；降低iPS細胞HIF-1a表達可加重缺氧對iPS細

14、胞增殖的抑制作用。2．缺氧處理12小時可促進iPS細胞遷移；降低HIF-1a表達，可明顯抑制缺氧促進iPS細胞遷移的作用。3．iPS細胞可自由穿過內皮細胞；缺氧處理可明顯抑制iPS細胞穿內皮細胞遷移；降低HIF-1a表達又會逆轉缺氧抑制遷移的現(xiàn)象，促進iPS細胞穿內皮遷移。4．缺氧處理12小時，對iPS細胞早期凋亡和晚期凋亡沒有顯著作用；但轉染HIF-1a siRNA降低缺氧誘導因子表達后，可在一定程度上抑制晚期凋亡。5．缺氧處理iPS

15、細胞明顯抑制iPS細胞與iPS細胞黏附以及iPS細胞與內皮細胞的粘附，降低缺氧誘導因子表達能逆轉此效應。6.缺氧處理可抑制iPS細胞SOD1、FGFR2、CCS、TEK、PLAU、NME4、MTA2等基因的RNA表達，降低iPS細胞HIF-1a表達能抑制缺氧對iPS細胞上述基因表達的影響。7.缺氧處理能促進iPS細胞在小鼠缺血腎臟中的遷移，降低HIF-1a表達后，iPS細胞遷移距離相對縮短。8.腎包膜下給予缺氧處理過的iPS細胞，與PB