血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-125和miR-126的功能研究.pdf

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞既是循環(huán)和組織器官間的第一道屏障，也是許多心血管活性物質(zhì)的主要來(lái)源，直接參與了心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)，其功能是維持循環(huán)系統(tǒng)平衡和穩(wěn)定的基礎(chǔ)。內(nèi)皮細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)又有賴于一系列心血管活性物質(zhì)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮素、一氧化氮和血管緊張素Ⅱ等等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的一種小分子調(diào)節(jié)物質(zhì)microRNA，能夠通過(guò)調(diào)控這些與內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)的基因的表達(dá)而參與內(nèi)皮細(xì)胞和血管功能的調(diào)節(jié)。尤其是一些血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性和高表達(dá)的microRNA，

2、在血管的生理和病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。miR-125和miR-126是目前報(bào)道的與血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管功能密切相關(guān)的microRNA。研究表明，miR-125家族的兩個(gè)成員：miR-125a和miR-125b在球囊損傷內(nèi)皮引起內(nèi)膜增生的血管中表達(dá)顯著下降；而在單核巨噬細(xì)胞中，miR-125a能夠?yàn)檠趸兔芏戎鞍状碳にT導(dǎo)表達(dá)增加，并能抑制單核巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝取以及炎癥因子的分泌，提示miR-125a/b參與了動(dòng)脈粥樣硬化疾

3、病的血管炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮損傷及內(nèi)膜增生等血管病理過(guò)程。miR-126是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的microRNA，它能夠通過(guò)調(diào)控Spred-1、VCAM-1、HoxA9、v-Crk、EGFL-7和VEGF等基因的表達(dá)參與調(diào)節(jié)血管發(fā)育、新生血管形成以及血管炎癥反應(yīng)等血管的生理和病理生理過(guò)程。
　　 方法：
　　 一、MicroRNA-125a/b抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮素-1基因表達(dá)及機(jī)制
　　 1、利用micro

4、RNA定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-125a和miR-125b在小鼠不同組織和細(xì)胞的表達(dá)分布，同時(shí)利用Western blot檢測(cè)ET-1基因初級(jí)翻譯產(chǎn)物：前內(nèi)皮素原(ppET-1)在這些組織細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 2、在H5V血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染pSuper-miR-125a和pSuper-miR-125b分別過(guò)表達(dá)miR-125a和miR-125b，Western Blot檢測(cè)前內(nèi)皮素原(ppET-1)的表達(dá)；利用miR-125a

5、inhibitor和miR-125b inhibitor在血管內(nèi)皮細(xì)胞分別下調(diào)miR-125a和miR-125b后，檢測(cè)ppET-1表達(dá)，研究miR-125a/b對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ppET-1表達(dá)的影響。
　　 3、構(gòu)建攜載ET-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)的pGL3重組螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，分別與pSuper-miR-125a和pSuper-miR-125b共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，檢測(cè)螢光素酶的活性；明確miR-125a和miR-125

6、b調(diào)控ET-1基因表達(dá)的機(jī)制。
　　 4、分別利用10μg/ml氧化低密度脂蛋白刺激H5V和b.END3兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞6、12、24、36和48小時(shí)，定量PCR檢測(cè)miR-125a和miR-125b的表達(dá)變化，同時(shí)利用Western Blot檢測(cè)ppET-1的表達(dá)變化。通過(guò)轉(zhuǎn)染pSuper-miR-125a和pSuper-miR-125b在H5V血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)分別過(guò)表達(dá)miR-125a和miR-125b后，再利用10μg/ml

7、氧化低密度脂蛋白刺激上述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞24小時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞總蛋白中ppET-1的表達(dá)以及培養(yǎng)上清液中ET-1的含量，明確miR-125a/b對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1表達(dá)的影響。
　　 5、檢測(cè)6周齡SHR-SP大鼠和WKY大鼠主動(dòng)脈中miR-125a、miR-125b和ET-1的表達(dá)。
　　 二、血管內(nèi)皮miR-126/126*通過(guò)抑制SDF-1的表達(dá)調(diào)控骨髓間充值干細(xì)胞的遷移
　　 1、利用micr

8、oRNA定量PCR方法檢測(cè)miR-126和miR-126*在小鼠不同組織和部分細(xì)胞中的表達(dá)分布；并檢測(cè)低氧培養(yǎng)和氯化鈷兩種模擬缺氧的理化刺激條件下H5V血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-126和miR-126*的表達(dá)變化，以及小鼠急性腦缺血模型腦組織中miR-126和miR-126*的表達(dá)變化。
　　 2、在血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)染pSuper-miR-126同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-126和miR-126*，隨后對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行低氧培養(yǎng)，West

9、ern blot檢測(cè)SDF-1蛋白表達(dá)變化，研究miR-126和miR-126*對(duì)低氧誘導(dǎo)SDF-1表達(dá)的影響；通過(guò)共轉(zhuǎn)染miR-126 inhibitor和miR-126* inhibitor同時(shí)下調(diào)miR-126和miR-126*的表達(dá)，檢測(cè)SDF-1蛋白的表達(dá)，研究在生理?xiàng)l件下下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-126和miR-126*對(duì)SDF-1表達(dá)的影響。同時(shí)利用ELISA檢測(cè)上述實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)上清液SDF-1的含量。
　　 3、

10、構(gòu)建攜載SDF-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)的pGL3重組質(zhì)粒，并分別對(duì)SDF-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)上預(yù)測(cè)的miR-126和miR-126*的作用靶序列進(jìn)行突變，得到兩種突變型的pGL3重組質(zhì)粒。通過(guò)將pSuper-miR-126、miR-126 mimic以及miR-126*mimic分別與這三種pGL3的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，檢測(cè)共轉(zhuǎn)染后重組螢光素酶報(bào)告基因的活性，研究miR-126和miR-126*對(duì)SDF-1基因mRN

11、A3'非翻譯區(qū)上各自預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的功能作用。
　　 4、分別利用miR-126 mimic和miR-126*mimic轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)或單獨(dú)過(guò)表達(dá)miR-126和miR-126*，檢測(cè)SDF-1的表達(dá)變化。利用miR-126 inhibitor和miR-126*inhibitor在血管內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)或單獨(dú)下調(diào)miR-126和miR-126*，檢測(cè)SDF-1的表達(dá)變化。研究單獨(dú)或同時(shí)過(guò)表達(dá)和下調(diào)miR-126及miR-126*對(duì)S

12、DF-1表達(dá)的影響及二者的相互關(guān)系。
　　 5、鑒于SDF-1對(duì)干細(xì)胞的趨化功能，在H5V血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-126和miR-126*后對(duì)其進(jìn)行低氧培養(yǎng)，利用體外Transwell遷移實(shí)驗(yàn)研究miR-126和miR-126*對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)向缺氧血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。
　　 二、血管內(nèi)皮miR-126/126*通過(guò)抑制SDF-1的表達(dá)調(diào)控骨髓間充值干細(xì)胞的遷移
　　 1、驗(yàn)證了miR-126是

13、一種血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性高表達(dá)的microRNA，同時(shí)也證明miR-126*也是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性高表達(dá)的microRNA；并且發(fā)現(xiàn)低氧培養(yǎng)和氯化鈷刺激均不影響H5V血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-126和miR-126*的表達(dá)，而在小鼠急性腦缺血模型腦組織miR-126和miR-126*表達(dá)均下調(diào)。
　　 2、在血管內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-126和miR-126*能夠顯著抑制低氧所誘導(dǎo)的SDF-1表達(dá)增加和分泌，而同時(shí)下調(diào)miR-1

14、26和miR-126*則能夠顯著誘導(dǎo)SDF-1的表達(dá)和分泌。
　　 3、利用pSuper-miR-126和miR-126/126*mimic同時(shí)和分別過(guò)表達(dá)miR-126和miR-126*均能夠抑制攜載野生型SDF-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)的螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)，而將SDF-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)上miR-126和miR-126*的靶位點(diǎn)突變后，miR-126和miR-126*對(duì)重組螢光素酶報(bào)告基因的抑制作用消失。

15、　　 4、在血管內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)過(guò)表達(dá)miR-126和miR-126*并不能抑制低氧所誘導(dǎo)的SDF-1表達(dá)增加，而單獨(dú)下調(diào)miR-126和miR-126*也不能誘導(dǎo)SDF-1的表達(dá)，只有同時(shí)過(guò)表達(dá)或下調(diào)miR-126和miR-126*才能夠抑制或誘導(dǎo)SDF-1的表達(dá)；同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-126和miR-126*對(duì)攜載野生型SDF-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)的重組螢光素酶報(bào)告基因的抑制作用比分別單獨(dú)過(guò)表達(dá)二者更為顯著。
　　 5、在血

16、管內(nèi)皮細(xì)胞利用pSuper-miR-126和miR-126/126*mimic同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-126和miR-126*能夠顯著抑制低氧誘導(dǎo)的MSC向缺氧血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移：同時(shí)下調(diào)miR-126和miR-126*則能夠誘導(dǎo)MSC向血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。
　　 結(jié)論：
　　 1、miR-125a和miR-125b均為血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的microRNA。
　　 2、miR-125a和miR-125b能夠通過(guò)作用于E

17、T-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)上特異性靶位點(diǎn)抑制ET-1基因的表達(dá)，并可能藉此參與ox-LDL刺激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1的表達(dá)調(diào)控以及SHR-SP大鼠血壓的調(diào)節(jié)。
　　 3、miR-126和miR-126*均為血管內(nèi)皮特異性高表達(dá)的microRNA。
　　 4、miR-126和miR-126*能夠作用于SDF-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)上各自特異性靶序列抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1的表達(dá)和分泌，二者作用具有協(xié)同效應(yīng)。