布魯氏菌BLS-L7-L12重組亞單位疫苗的初步研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)(簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌(BrLicella．spp)引起的人、畜共患傳染病。世界上有170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有人、畜布病存在和流行。在我國(guó)布病已波及28個(gè)省市區(qū)，并且近年呈死灰復(fù)燃，給畜牧業(yè)和人類的健康帶來嚴(yán)重危害，因此防控布魯氏菌病形勢(shì)相當(dāng)嚴(yán)峻。 布魯氏菌屬包括新發(fā)現(xiàn)的海洋哺乳動(dòng)物種在內(nèi)，有7種21個(gè)生物型，感染人的主要有牛、羊、豬三種。布魯氏菌是革蘭氏陰性菌，兼性寄生于巨噬細(xì)胞內(nèi)，從而逃避宿

2、主的免疫清除，它主要引起人的波狀熱和慢性感染，造成反芻動(dòng)物不育和流產(chǎn)等，同時(shí)它又是一種潛在的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑?？刂撇剪斒暇鞑リP(guān)鍵是進(jìn)行疫苗接種，目前在一些國(guó)家使用的弱毒疫苗(牛型19號(hào)疫苗以及羊Rev.1弱毒苗)對(duì)預(yù)防布魯氏菌病能夠起到一定的作用，但弱毒疫苗接種與感染難以鑒別以及存在潛在安全性的問題，因此研制新一代布魯氏菌病疫苗成為生命科學(xué)的重要課題。 當(dāng)前布魯氏菌新型疫苗的研究主要集中在毒力相關(guān)基因缺失的突變株疫苗和重

3、組亞單位疫苗兩個(gè)領(lǐng)域。突變株疫苗雖然有較好的保護(hù)性，但安全性和穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步的評(píng)價(jià)，并且可能有毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象。布魯氏菌重組亞單位疫苗能產(chǎn)生一定的免疫原性和免疫保護(hù)性，但保護(hù)效果不完全。于是我們認(rèn)為，采用多價(jià)保護(hù)性抗原分子和利用不同的抗原提呈系統(tǒng)開展的布魯氏菌重組亞單位疫苗的研究，可能為新型布魯氏菌疫苗提供一條可行途徑。 本研究首先從布魯氏菌M16中克隆L7/L12和BLS基因，并進(jìn)一步用重疊延伸PCR擴(kuò)增BLS-L7/L12基

4、因，分別構(gòu)建在pET32a表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌8L21，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化相應(yīng)重組蛋白，鋁鹽吸附制備L7/L12、BLS和BLS-L7/L12重組蛋白疫苗；同時(shí)將3種蛋白抗原基因克隆到真核表達(dá)載體pVAX1上，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后證明有目的蛋白表達(dá)，大提質(zhì)粒制備L7/L12、BLS和BLS-L7/L12 DNA疫苗；并利用依賴asd基因的宿主-載體平衡致死系統(tǒng)，把BLS-L7/L12基因轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌，構(gòu)建以減毒沙門氏菌為載體的B

5、LS-L7/L12蛋白疫苗和基因疫苗。 隨后將候選的BLS-L7/L12蛋白疫苗、DNA疫苗和減毒沙門氏菌為載體的蛋白疫苗和基因疫苗疫苗分別免疫Balb/c小鼠，三免后ELISA測(cè)定結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組均能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體；抗體亞型分類實(shí)驗(yàn)表明重組蛋白疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生Th2型為主的免疫應(yīng)答，DNA疫苗及以減毒沙門氏菌為載體的疫苗產(chǎn)生Th1型為主的免疫應(yīng)答；MTT法測(cè)定免疫Balb/c小鼠T淋巴細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)DNA組及以減毒沙門氏菌為載

6、體的疫苗組脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)，而重組蛋白疫苗組卻無顯著變化；FCM測(cè)定疫苗免疫Balb/c小鼠淋巴細(xì)胞亞群分類，CD4<'+>/CD8<'+>DNA疫苗組及減毒沙門氏菌組減少，而重組蛋白組有升高趨勢(shì)；ELISPOT檢測(cè)特異性活化的可分泌IFN-γ的CD8<'+>T細(xì)胞數(shù)，DNA免疫組的斑點(diǎn)數(shù)顯著多于對(duì)照組。牛種布魯氏菌544A強(qiáng)毒株對(duì)免疫Balb/c小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)證明我們所構(gòu)建的疫苗都具有一定的免疫保護(hù)性，DNA疫苗好于蛋白疫苗，