HPV45L1重組蛋白疫苗的制備與性質(zhì)研究.pdf

1、據(jù)WHO報(bào)道，宮頸癌為女性人群中最主要的癌癥之一。高危型人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)感染是引起女性宮頸癌的主要病因。2008年以來，每年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例超過50萬人，在中國每年也有約10萬被確診罹患宮頸癌。有15種高危型HPV能誘發(fā)宮頸癌，除HPV16/18這兩種主要型別外，HPV45型也是一種高危型病毒，雖然在全球?qū)m頸癌的流行分布上，HPV45只與4.4％的宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，在所有的高危型別

2、中位列第5位，但在歐洲和非洲一些國家，HPV45型卻極為常見，在某些地區(qū)，甚至與HPV18相當(dāng)或略高。因此，有必要開發(fā)一種針對HPV45的疫苗來有效的控制該疾病的發(fā)生。
　　 研究證實(shí)，HPV主要衣殼蛋白L1在體外一定的條件下，能自組裝成具有與天然病毒類似的顆粒結(jié)構(gòu)，并能模擬病毒的表位，是一種良好的疫苗形式。本研究利用大腸桿菌系統(tǒng)成功地表達(dá)可溶性HPV45L1編碼蛋白，通過的2步驟柱純化模式:陽離子交換層析和羥基磷灰石層析后，獲

3、得了純度達(dá)95％以上的目標(biāo)蛋白—HPV45L1。并嘗試其自組裝條件的摸索，發(fā)現(xiàn)在20mM PB7.4、0.5M NaCl條件下，HPV45L1能較好地組裝成VLPs。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們嘗試對該小量制備實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行中試水半的放大，對藥典規(guī)定各項(xiàng)檢測指標(biāo)進(jìn)行合理檢測，結(jié)果表明，該中試工藝符合疫苗生產(chǎn)工藝要求。
　　 本研究將中試生產(chǎn)的HPV45 L1 VLPs混合鋁佐劑制成疫苗，免疫小鼠，通過ELISA檢測實(shí)驗(yàn)及假病毒中和實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)

4、果表明，該疫苗能產(chǎn)生104-106的抗體滴度，驗(yàn)證了HPV45 L1 VLPs具有較好的保護(hù)性，同時(shí)動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示，半數(shù)有效量(ED50)為0.007μg。驗(yàn)證了HPV45 L1 VLP用于疫苗生產(chǎn)的可行性。同時(shí)，通過小鼠免疫，我們篩選得到了15株線性或構(gòu)象的單克隆抗體，為后續(xù)HPV45L1五聚體及VLPs相關(guān)性質(zhì)鑒定奠定基礎(chǔ)。
　　 為進(jìn)一步了解HPV45 L1 VLPs的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，本研究采用冷凍電鏡技術(shù)，對中試生產(chǎn)的VLP

5、s進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，初步獲得一個(gè)22(A)的三維重建結(jié)構(gòu)。證實(shí)了本研究獲得的HPV45 L1 VLPs完全可以模擬病毒的天然構(gòu)象，保證了疫苗的可靠性。
　　 綜上所述，本論文從現(xiàn)階段研究宮頸癌病源體—HPV這一熱點(diǎn)出發(fā)，利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)高危型HPV45L1編碼蛋白，通過其自組裝條件摸索，中試工藝放大，原液檢定，冷凍電鏡重建三維結(jié)構(gòu)技術(shù)等于段，驗(yàn)證了其成為疫苗的可能性，并通過單克隆抗體篩選鑒定，獲得了能用于疫苗性質(zhì)鑒定的可靠保證。