以Fc和LTB為載體的豬口蹄疫亞單位疫苗的初步研究.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)被國(guó)際獸疫局(OIE)列為A類疾病，是一種偶蹄動(dòng)物易感的熱性，急性，高度接觸性傳染病?？谔阋弑l(fā)會(huì)造成政治和經(jīng)濟(jì)上相當(dāng)嚴(yán)重的損失。我國(guó)目前通過(guò)接種滅活苗疫苗的方法來(lái)控制該病的流行，滅活疫苗雖然具有良好的免疫原性，但存在病毒滅活不徹底甚至活毒逃逸等不安全因素。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，多種新型疫苗因?yàn)榘踩煽?，容易進(jìn)行質(zhì)量控制等優(yōu)點(diǎn)吸引了更多研究人員的注意。其中，重組亞單位疫苗只

2、含有完整病毒的有效的免疫結(jié)構(gòu)，能夠刺激產(chǎn)生免疫保護(hù)的同時(shí)還保證了疫苗使用的安全性，同時(shí)其生產(chǎn)制備手段已趨于成熟，生產(chǎn)成本低廉，因而是獸用疫苗的最佳研究和發(fā)展方向。
　　VP1蛋白是FMDV唯一刺激能產(chǎn)生中和抗體的最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，尤其是G-H環(huán)的140～160和200～213氨基酸殘基，它含有的包含B細(xì)胞抗原表位141-160aa及200-213aa,是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的免疫表位，從而產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。因此VP1蛋白是研究口

3、蹄疫亞單位疫苗的理想抗原。
　　國(guó)內(nèi)學(xué)者已有報(bào)道成功的以豬免疫球蛋白IgG Fc為載體的豬FMDV亞單位疫苗，并具有較好的免疫保護(hù)效果，但是由于融合表達(dá)產(chǎn)物為包涵體，工藝無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)以前人的研究成果為基礎(chǔ)，利用新型的原核系統(tǒng)表達(dá)平臺(tái)嘗試對(duì)融合產(chǎn)物進(jìn)行可溶表達(dá)，并對(duì)重組蛋白的免疫原性進(jìn)行鑒定，為重組蛋白大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用進(jìn)行初步的探索。本研究以FMDV O/MYA98株結(jié)構(gòu)蛋白VP1的141～160aa-200～213a

4、a為目標(biāo)基因，以豬免疫球蛋白IgG Fc片段和大腸桿菌不耐熱腸毒素LTB為載體，利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了兩種FMDV VP1的重組蛋白，并對(duì)重組蛋白的免疫原性進(jìn)行了初步研究。具體主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.以豬IgG Fc為載體的O型FMDV VP1蛋白主要抗原表位的表達(dá)與鑒定。
　　本實(shí)驗(yàn)選取FMDV O/MYA98株結(jié)構(gòu)蛋白VP1上141-160aa及200-213aa的序列，以豬免疫球蛋白IgG Fc片段為載體，

5、連接pQZ載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQZ-Fc-loop，利用大腸桿菌可溶性表達(dá)平臺(tái)CVC1102對(duì)融合基因進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE鑒定表明，獲得的重組蛋白Fc-loop大小為42kDa,存在于超聲破碎后上清中，為可溶性蛋白。Western-bloting分析顯示，F(xiàn)c-loop能與兔抗FMDV VP1特異性陽(yáng)性血清呈陽(yáng)性反應(yīng)。
　　2.以LTB為載體的O型FMDV VP1蛋白主要抗原表位的表達(dá)與鑒定。
　　本實(shí)驗(yàn)選取FMDV

6、O/MYA98株結(jié)構(gòu)蛋白VP1上141-160aa及200-213 aa的序列，以大腸桿菌不耐熱腸毒素LTB為載體，連接pQZ載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQZ-LTB-loop，利用大腸桿菌可溶性表達(dá)平臺(tái)CVC1102對(duì)融合基因進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE鑒定表明，獲得的重組蛋白LTB-loop大小為23 kDa,為可溶性蛋白。Western-bloting分析顯示，LTB-loop能與兔抗FMDV VP1特異性陽(yáng)性血清呈陽(yáng)性反應(yīng)。
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7、.FMDV VP1重組蛋白免疫原性的初步研究。
　　利用BCA法對(duì)獲得的兩種重組蛋白進(jìn)行蛋白定量，總蛋白分別為為2mg/ml、1mg/ml，將定量后的重組蛋白與206佐劑混合乳化后，獲得試驗(yàn)性疫苗，4℃保存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)選取ICR小鼠，分為5組，分別頸背部皮下多點(diǎn)接種免疫200μl/只Fc-loop、LTB-loop重組蛋白疫苗、添加免疫增強(qiáng)劑CVC1302的Fc-loop、LTB-loop重組蛋白疫苗，最后組作為空白對(duì)照組。14天

8、后加強(qiáng)免疫，一免后14、22、28、55天眼眶采血，ELISA檢測(cè)FMDV VP1抗體水平。結(jié)果表明:pQZ-Fc-loop、pET-LTB-loop均能刺激免疫小鼠產(chǎn)生特異性抗體，pQZ-Fc-loop的抗體水平高于pET-LTB-loop的抗體水平，添加免疫增強(qiáng)劑CVC1302后抗體水平獲得不同程度的提高。
　　4.FMDV VP1重組蛋白的初步純化。
　　為了提高未經(jīng)純化的重組亞單位疫苗的免疫保護(hù)效果，需要對(duì)重組蛋白進(jìn)