蠟狀芽孢桿菌β-CGTase發(fā)酵、基因克隆表達及其酶學性質(zhì)研究.pdf

1、β-CGTase因為其廣泛的應(yīng)用價值，特別是在生產(chǎn)β-CD和藥物分子修飾等方面有著巨大的前景。
　　論文首先篩選得到一株高產(chǎn)β-CGTase的菌株，然后對菌株進行了鑒定，確定為是蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)。以該蠟狀芽孢桿菌BC-0801為出發(fā)菌株，利用10 keV，劑量為40×2.5×1013ions/cm2氮離子進行誘變選育，獲得一株高產(chǎn)β-CGTase的菌株BC0802。然后對菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，其最適

2、培養(yǎng)基為：玉米粉3％，玉米漿1％，蛋白胨1％，酵母浸膏1.5％，K2HPO40.05％、MgSO4·7H2O0.01％；最適發(fā)酵pH為9.0，接種量為4％，發(fā)酵時間為36h，發(fā)酵溫度為30℃。
　　在獲取最佳產(chǎn)酶條件的基礎(chǔ)上，從發(fā)酵液中提取粗酶液，再經(jīng)過硫酸銨分級沉淀和Sephadex G-150分離得到β-CGTase純品。經(jīng)SDS-PAGE測得酶的分子量為75kDa，Km=2.8153 g/L；酶的最適溫度為60℃，最適pH為

3、7.0，Ca2+對酶活有較大的促進作用，Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、CO2+、SDS對酶均有較強的抑制作用。
　　其次，通過分子生物學手段，對蠟狀芽孢桿β-CGTase的基因進行了克隆，構(gòu)建了溫控型表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，最終實現(xiàn)了表達。工程菌的最佳誘導(dǎo)條件為：菌濃OD600為1.0，誘導(dǎo)時間為4h，起始培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為30℃，pH為8.0。誘導(dǎo)溫度的分配為39℃，2h，41℃，1h，42

4、℃，lh。從工程菌株體內(nèi)提取粗酶液，再通過硫酸銨鹽析、透析、Sephadex G-150凝膠分離得到較純的β-CGTase。經(jīng)SDS-PALGE測定該重組酶的分子量為85kDa，Km值為2.4508 g/L-1，最適溫度為65℃，且該酶較耐高溫，在90℃條件下，4h后酶活才會顯著下降50％，在100℃下經(jīng)過2h后酶活才會顯著下降70％，最適pH為9.0。脲和Ca2+和Fe2+對酶活具有一定的促進作用，Mg2+、Zn2+、Tris、Co2

5、+等對酶有很強的抑制作用。
　　將β-CGTase分別構(gòu)建在以大腸桿菌DH5α為宿主的pET28質(zhì)粒和以枯草芽孢桿菌為宿主的pAX01質(zhì)粒上。且β-CGTase在這兩株工程菌體內(nèi)均實現(xiàn)了表達。
　　通過對蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)β-CGTase從菌株篩選、誘變到發(fā)酵條件優(yōu)化，再到分子生物學研究，獲得了一株高產(chǎn)β-CGTase的蠟狀芽孢桿菌突變菌株和一株高產(chǎn)嗜熱β-CGTase的工程菌株，建立了一個系統(tǒng)的研究方法，為將來的工業(yè)化生產(chǎn)奠定