芽孢桿菌N19中性蛋白酶發(fā)酵條件及其酶學性質研究.pdf

1、中性蛋白酶是指其最適作用pH介于6.0～7.5之間的一類蛋白酶，能催化蛋白質肽鍵水解，具有催化反應速度快，無工業(yè)污染，催化反應條件適應性寬等獨特的性質和優(yōu)點。 本研究以酶工程實驗室所保存的一株芽孢桿菌(Bacillus)N19為出發(fā)菌株，在搖瓶發(fā)酵水平上，對其發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行了研究，確定了其最佳培養(yǎng)基成分及最佳培養(yǎng)條件。研究了不同碳源、氮源、無機鹽、金屬離子等因素對芽孢桿菌(Bacillus)N19產(chǎn)酶的影響，發(fā)現(xiàn)牛肉膏、蛋白胨

2、、酵母膏、NaCl濃度對產(chǎn)酶的影響較大。對此四因素各選取三個水平進行正交試驗，確定芽孢桿菌(Bacillus)N19產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基成分為牛肉膏11g/L,酵母膏12 g/L，蛋白胨20 g/L，NaCl 4 g/L。通過搖瓶發(fā)酵試驗，確定其最佳培養(yǎng)條件為:搖床42℃，250 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH為4.5，接種量2％(V/V)，裝液量為40 mL/300mL，培養(yǎng)44h。 芽孢桿菌中性蛋白酶在37℃發(fā)酵后，收集發(fā)酵液

3、，經(jīng)過濾、硫酸銨鹽析、Sephadex G-25脫鹽、DEAE-維素-52離子強度梯度層析、SephacrylTM S-200凝膠過濾等純化工藝分離純化之后，經(jīng)PAGE電泳鑒定得到單一條帶，達到電泳純。比活力提高到6214.7U/mg，純化倍數(shù)為20.1倍，回收率為12.87％。 純化的芽孢桿菌中性蛋白酶以酪蛋白為底物時的酶學性質為:最適溫度70℃，在低于60℃或者高于80℃時，相對酶活力明顯下降；該中性蛋白酶在50℃下作用2h

4、，其相對酶活只有26.35％，而60℃只有3.6％，70℃下處理20分鐘酶活下降至14.3％；最適pH為6.8，作用范圍較寬，在pH6.0～8.0范圍內(nèi)均具有較高的酶活性，pH耐受性比較好；Fe2+對中性蛋白酶有顯著激活作用，可使其酶活提高394.65％，EDTA對酶活有一定的抑制作用；以酪蛋白為底物采用雙倒數(shù)作圖法測得Km為3.1×10-3g/mL；SDS-PAGE電泳顯示芽孢桿菌中性蛋白酶分子量37.7KDa。 本論文對芽孢