基于滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和納米材料的生物傳感新方法的研究.pdf

1、生命體中蛋白質(zhì)、核酸、酶活性以及生物小分子活動(dòng)信息的研究對(duì)生物醫(yī)學(xué)以及臨床診斷和治療有著非常巨大的意義。如何實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、快速、準(zhǔn)確地獲取這些生命活動(dòng)的信息，就成為了分析化學(xué)科研工作者面臨的重大的挑戰(zhàn)。為了克服這個(gè)難題，就需要我們發(fā)展一些準(zhǔn)確性高、靈敏度高以及特異性高的定性或定量的方法，達(dá)到獲取信息的目的。本論文瞄準(zhǔn)上述挑戰(zhàn)進(jìn)行研究，基于滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和納米材料發(fā)展了一系列分別以小分子、核酸、蛋白質(zhì)和酶活性為檢測(cè)對(duì)象的高靈敏性高選擇性的生物

2、傳感技術(shù)，并通過對(duì)實(shí)際樣品的分析，初步驗(yàn)證了這些技術(shù)的可行性和準(zhǔn)確性。
　　第2章中，單個(gè)細(xì)胞中microRNA的空間分布和表達(dá)水平對(duì)于考察microRNA及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性在生物學(xué)中的作用具有十分重要的意義。我們開發(fā)一種基于目標(biāo)自引物等溫滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)高靈敏高選擇性的原位檢測(cè)腫瘤細(xì)胞microRNA。該方法，首先利用改良的microRNA固定方法，將microRNA的5'端磷酸基團(tuán)與細(xì)胞中蛋白質(zhì)的氨基通過EDC共價(jià)交聯(lián)，達(dá)到固定

3、microRNA的目的。然后預(yù)先制備的DNA環(huán)狀探針與microRNA經(jīng)過原位雜交，microRNA作為引物，在dNTPs和聚合酶的作用下進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生一條長(zhǎng)的與環(huán)形DNA模板互補(bǔ)的單鏈DNA。細(xì)胞原位產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物利用熒光染料標(biāo)記的探針雜交識(shí)別，由于滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物可以與成千上萬(wàn)的熒光染料標(biāo)記探針雜交，從而達(dá)到目標(biāo)microRNA高靈敏的可視化的檢測(cè)。由于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)只能由microRNA游離的3'端觸發(fā)，因此從根本上消除了mRN

4、A以及microRNA前體的干擾。我們使用這種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和人正常細(xì)胞株L02細(xì)胞中mir-222與mir-223表達(dá)水平的高靈敏的可視化檢測(cè)，并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞中不同microRNA的同時(shí)檢測(cè)。我們認(rèn)為目標(biāo)觸發(fā)的基于目標(biāo)自觸發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增原位檢測(cè)方法是可靠的研究疾病相關(guān)的microRNA表達(dá)分析方法，在基礎(chǔ)研究和臨床診斷上具有很大的應(yīng)用潛力。
　　第3章中，DNA甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳修飾，在

5、調(diào)節(jié)基因表達(dá)的過程中通過影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，DNA構(gòu)象、穩(wěn)定性以及與蛋白質(zhì)相互作用方式等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。DNA甲基化目前已成為多種腫瘤診斷的生物標(biāo)志物。高靈敏高特異性的檢測(cè)CpG島DNA甲基化表型對(duì)于甲基化的研究和臨床診斷都具有非常重大的意義。在本章中，我們將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)與DNA為模板形成熒光特性的銀納米簇相結(jié)合發(fā)展了一種可用于實(shí)際體系中DNA甲基化檢測(cè)的方法。該方法首先將DNA經(jīng)過亞硫酸鹽的處理，再利用EcoliDNA連接酶對(duì)錯(cuò)配的堿基對(duì)高特

6、異性識(shí)別，在進(jìn)行退火連接-變性解鏈的熱循環(huán)過程中，亞硫酸鹽處理后的甲基化的目標(biāo)DNA與經(jīng)過合適設(shè)計(jì)的與其具有完全互補(bǔ)堿基對(duì)的掛鎖探針雜交，通過連接酶的作用下產(chǎn)生連接產(chǎn)物，該連接產(chǎn)物自身具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并有完整的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。銀納米簇DNA模板作為引物，在具有強(qiáng)鏈置換能力的DNA聚合酶的作用下自發(fā)啟動(dòng)聚合酶延伸反應(yīng)以及鏈置換的恒溫滾環(huán)放大反應(yīng)，隨后在限制性內(nèi)切酶的作用下，釋放出大量可以合成銀納米簇的DNA模板。在硝酸銀、硼氫化鈉的作

7、用下，產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA甲基化的檢測(cè)。該方法設(shè)計(jì)巧妙新穎，有較高的靈敏度和選擇性，檢測(cè)限達(dá)6.4fM。
　　第4章中，基于鳥嘌呤可觸發(fā)DNA為模板合成銀納米簇?zé)晒庠鰪?qiáng)的性質(zhì)發(fā)展了一種高靈敏檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性的分析方法。在該方法中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一條包含合成銀納米簇模板的端粒酶擴(kuò)增引物序列，未存在端粒酶的時(shí)候，此模板合成出熒光信號(hào)很弱的銀納米簇。在目標(biāo)端粒酶的作用下，引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出富含G堿基的TTAGGG重復(fù)

8、序列，此時(shí)合成銀納米簇不僅使得熒光信號(hào)有很大的增強(qiáng)，同時(shí)熒光發(fā)射波譜紅移。這種方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hela細(xì)胞中端粒酶活性的高靈敏檢測(cè)，動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍為500到50000個(gè)細(xì)胞，并且在該范圍內(nèi)峰熒光信號(hào)與HeLa細(xì)胞個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，同時(shí)該方法具有較高選擇性，線性范圍寬，高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。
　　第5章中，基于核酸適配體探針可自組裝在二硫化鉬納米片的表面上形成穩(wěn)定的適配體-二硫化鉬納米片結(jié)構(gòu)的生物傳感器，發(fā)展了一種高靈敏的蛋白質(zhì)和生

9、物小分子的檢測(cè)新方法。修飾了熒光素的核酸適配體探針自組裝在二硫化鉬納米片的表面，依舊保持核酸適配體高的特異性和親和力。這種復(fù)合結(jié)構(gòu)可以作為低背景的平臺(tái)用于ATP和凝血酶的檢測(cè)。當(dāng)靶目標(biāo)不存在時(shí)，熒光探針與MoS2發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光被顯著淬滅。當(dāng)靶目標(biāo)存在的情況下，靶物質(zhì)與核酸適配體結(jié)合具有高的特異性和親和力，誘導(dǎo)核酸適配體其形成更加剛性的分子結(jié)構(gòu)，這種剛性結(jié)構(gòu)的形成減弱了核酸適配體與MoS2的之間的范德華力作用，使得核酸適配體不

10、能被MoS2有效的吸附淬滅，適配體探針與靶目標(biāo)結(jié)合脫離二硫化鉬納米片的表面，熒光恢復(fù)。該方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高選擇性好，也可以通過靈活的使用不同的核酸適配體和DNA修飾上不同的熒光基團(tuán)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域多組分物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)。
　　第6章中，多聚核苷激酶(PNK)對(duì)DNA的磷酸化修飾過程在許多的生理活動(dòng)中起著非常重要的作用。本章以T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4PNK)為模型，基于

11、磷酸化的DNA被特異性外切酶降解結(jié)合WS2獨(dú)特的吸附和淬滅性能發(fā)展了一種熒光方法用于T4PNK酶活性的測(cè)定。由于WS2與雙鏈DNA的結(jié)合力較弱不能有效淬滅染色雙鏈產(chǎn)物的熒光，因此得到較強(qiáng)的熒光信號(hào)。雙鏈DNA作為T4PNK的底物，當(dāng)T4PNK作用之后，雙鏈DNA模板將被磷酸化，導(dǎo)致雙鏈DNA立即被λ核酸外切酶降解，產(chǎn)生得到的單鏈DNA被WS2強(qiáng)烈吸附同時(shí)淬滅其熒光。WS2的超強(qiáng)熒光淬滅能力也為該方法提供了有較寬的線性范圍和低的檢測(cè)限，其