水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留膠體金免疫層析檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用.pdf

1、水產(chǎn)品中獸藥殘留問(wèn)題日益突出，獸藥雖在養(yǎng)殖過(guò)程中帶來(lái)不少作用，但攝入人體后對(duì)人體危害大，嚴(yán)格把控水產(chǎn)品中的獸藥殘留就顯得尤為重要。恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR)是第三代喹諾酮類(lèi)藥物，由于其在組織液中濃度達(dá)到最高值速度快、組織分布范圍廣、抑菌的數(shù)量和種類(lèi)多等諸多優(yōu)點(diǎn)，且其代謝產(chǎn)物均有良好的抗菌作用，所以廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的疾病防治。由于部分養(yǎng)殖戶(hù)存在不規(guī)范用藥，容易導(dǎo)致恩諾沙星隨著食物鏈進(jìn)入人體，造成軟骨組織、中樞神經(jīng)、消

2、化系統(tǒng)等方面的損傷，同時(shí)較大劑量還會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)的遲緩、肝臟損傷及皮膚過(guò)敏等個(gè)方面的問(wèn)題。
　　本文通過(guò)采用膠體金免疫檢測(cè)法，研究適用于現(xiàn)場(chǎng)快速監(jiān)測(cè)水產(chǎn)品中ENR殘留的檢測(cè)體系。膠體金免疫層析法具有檢測(cè)速度快、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于這類(lèi)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。本次研究主要獲得以下結(jié)果:
　　1.ENR-OVA人工抗原的合成。采用N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法將ENR偶聯(lián)到OVA上，經(jīng)FPLC、紫外、SDS-PAGE電泳等的檢測(cè)分析

3、，ENR與OVA偶聯(lián)成功，可以用于進(jìn)一步試驗(yàn);
　　2.多克隆抗體的制備。利用人工合成的抗原ENR-OVA免疫新西蘭大白兔，抗血清經(jīng)飽和硫酸銨法純化后，用ELISA間接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)得效價(jià)在1∶8000～1∶64000。其中以1號(hào)兔子的抗血清效果較佳，在此基礎(chǔ)上建立的ELISA間接競(jìng)爭(zhēng)法，檢測(cè)ENR濃度在0.1～8.1ng/mL之間，以結(jié)合率B/B0值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)作曲線(xiàn)，通過(guò)擬合曲線(xiàn)獲得方程:y=-40.613 lg(x

4、)+58.963，R2=0.9959，IC50為1.662。
　　3.膠體金制備。采用Frens法制備出20 nm左右的膠體金顆粒，用K2CO3調(diào)pH到8.2，然后逐滴加入2 mL0.1 mg/mL的ENR-PcAb溶液，用BSA封閉，采用高速離心法純化，最終獲得深紅色膠體金溶液。
　　4.試紙條制備工藝確定。膠體金標(biāo)記恩諾沙星多克隆抗體噴膜量為65μL/cm2;Millipore的M180 NC膜;檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)（劃膜量均

5、為1.0μL/cm）;ENR-OVA和羊抗兔IgG包被濃度均為1000 mg/L;樣品墊前處理，用含1％ PVP的0.01 mol/L PBS(pH7.5)。采用此工藝制備出的試紙條最低檢測(cè)限可低至0.9ng/mL，在蝦和魚(yú)組織中肉眼最低檢測(cè)限分別為5 ng/g、10 ng/g。與ELISA間接競(jìng)爭(zhēng)法比對(duì)中，試紙條對(duì)蝦、魚(yú)中ENR濃度分別大于5 ng/mL、10 ng/mL的樣本，均能有效檢出陽(yáng)性，而低于該值時(shí)顯色為陰性。試紙條在常溫干