全局轉(zhuǎn)錄工程選育耐乳酸鼠李糖乳酸桿菌.pdf

1、乳酸及其衍生物被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的鼠李糖乳酸桿菌因其在調(diào)節(jié)腸道菌群等方面的功效受到廣泛關(guān)注,然而有關(guān)鼠李糖乳酸桿菌的基因工程菌種選育的報(bào)道并不多見,因而穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是必要的,同時(shí)在乳酸菌發(fā)酵過程中有很明顯的產(chǎn)物抑制效應(yīng),限制了乳酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
　　本研究采用全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程(gTME),通過易錯(cuò)PCR在σ70因子的表達(dá)框中引入突變,構(gòu)建重組載體并導(dǎo)入受體菌株獲得轉(zhuǎn)錄突變庫,通

2、過壓力篩選獲得耐乳酸鼠李糖乳酸桿菌。
　　(1)建立了鼠李糖乳酸桿菌的基因工程操作體系。質(zhì)粒提取時(shí)最優(yōu)溶菌酶處理?xiàng)l件為:30mg/ml、37℃處理30min。電轉(zhuǎn)化條件為:使用2％甘氨酸進(jìn)行預(yù)弱化一次,OD600為0.2~0.3時(shí)加入氨芐青霉素使終濃度達(dá)到12μg/mL,收集OD600為0.4的細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞,電場(chǎng)強(qiáng)度為8.5kv/cm,電擊時(shí)間4ms。
　　(2)通過恒化器培養(yǎng)篩選法、液體壓力沖擊法和壓力平板篩選法三種