保加利亞乳酸桿菌分解尿毒素的定向誘變.pdf

1、目的:
　　利用先誘導(dǎo)后誘變的方法，篩選出具有高效分解多種尿毒素，并且能穩(wěn)定遺傳的乳酸菌，為慢性腎衰的腸道細(xì)菌療法提供新菌種。
　　方法:
　　1.將原始保加利亞乳酸桿菌菌液置于尿毒癥病人血清中反應(yīng)24小時(shí)后，取上層血清測(cè)定其對(duì)肌酐基礎(chǔ)降解能力。
　　2.原始保加利亞乳酸桿菌株的定向誘導(dǎo):將原始菌株接種于尿毒癥病人血清中培養(yǎng)傳代，每隔5代檢測(cè)血清中肌酐濃度，直到出現(xiàn)能降解肌酐的菌株，為陽(yáng)性菌株。
　　3.最

2、佳誘變劑的選定:測(cè)出原始保加利亞乳酸菌的生長(zhǎng)曲線一＞確定生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期一＞確定紫外線及硫酸二乙酯的作用時(shí)間一＞制備懸菌液一＞紫外線誘變、硫酸二乙酯誘變、硫酸二乙酯-紫外線復(fù)合誘變處理一＞稀釋后涂布篩選平板培養(yǎng)一＞挑取生長(zhǎng)良好的菌株置入尿毒癥病人血清中反應(yīng)一＞選擇能使肌酐濃度下降幅度最大的菌株進(jìn)行下一輪的誘變，依次類推進(jìn)行三輪誘變一＞經(jīng)過(guò)三輪誘變后，選出降解肌酐強(qiáng)的菌株進(jìn)行復(fù)篩并進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性研究一＞確定能使菌株降解肌酐能力提高幅度最大的誘變

3、劑。
　　4.誘導(dǎo)后的保加利亞乳酸桿菌株的誘變:誘導(dǎo)后的陽(yáng)性菌株制成菌懸液，運(yùn)用最佳誘變劑進(jìn)行三輪誘變，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，篩選出降解肌酐能力最強(qiáng)的菌株，并進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性研究。
　　5.降解尿毒素的研究:誘導(dǎo)結(jié)合誘變選出的陽(yáng)性菌制成菌懸液置于尿毒癥病人血清中，以不含菌液尿毒癥病人血清、原始菌株，誘導(dǎo)菌株，單獨(dú)誘變選出的肌酐分解率最高的菌株為對(duì)照組，反應(yīng)24小時(shí)后取上層血清測(cè)定其降解肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲狀旁腺素、同型半胱氨

4、酸的情況。
　　結(jié)果:
　　1.原始保加利亞乳酸桿菌接種入尿毒癥病人血清中，作用24小時(shí)后，作用前后肌酐的濃度沒(méi)有明顯變化(P＞0.05)。
　　2.原始保加利亞乳酸桿菌在尿毒癥病人血清中傳代20次后，稀釋后在尿毒癥病人血清反應(yīng)24小時(shí)后，血清中肌酐濃度與空白對(duì)照組、原始菌株相比明顯下降(P＜0.05)。
　　3.利用紫外線、硫酸二乙酯、硫酸二乙酯-紫外線三種誘變劑對(duì)原始保加利亞乳酸桿菌株進(jìn)行三輪誘變處理，結(jié)果表

5、明復(fù)合誘變效果最佳,最后篩選出DU3-12，肌酐分解率比原始菌株提高了9.86％的工程菌。
　　4.經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)和誘變處理的保加利亞乳酸桿菌，通過(guò)初篩和復(fù)篩，篩選出對(duì)肌酐降解能力明顯提高的菌株DUC3-17，其肌酐分解率達(dá)17.23％，比誘導(dǎo)后菌株提高了11.90％，比原始菌株提高了16.19％。
　　5.在尿毒癥病人血清中連續(xù)傳代5次后，DU3-12、DUC3-17仍能顯著地降低血清中肌酐的濃度，遺傳穩(wěn)定性較好。
　　6

6、.將菌懸液置于尿毒癥病人血清中反應(yīng)24小時(shí)后，與空白對(duì)照組比較，原始保加利亞乳酸桿菌組肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲狀旁腺素、同型半胱氨酸的濃度沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）;誘導(dǎo)菌株組肌酐、尿素氮、尿酸的濃度明顯變化（P＜0.05），血磷、甲狀旁腺素、同型半胱氨酸濃度無(wú)明顯變化(P＞0.05);DU3-12組肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲狀旁腺素的濃度明顯下降(P＜0.05)，同型半胱氨酸的濃度無(wú)明顯變化(P＞0.05); DUC3-17與

7、所有對(duì)照組比較，肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲狀旁腺素的濃度有明顯變化（P＜0.05），與DU3-12相比，僅有同型半胱氨酸濃度無(wú)明顯變化（P＞0.05）。DUC3-17肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲狀旁腺素、同型半胱氨酸的分解率分別比是17.23％,36.02％,9.84％,15.73％,78.26％,12.69％。
　　結(jié)論:
　　1.原始保加利亞乳酸桿菌不具有降解肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲狀旁腺素、同型半胱氨酸的能力。<

8、br>　　2.原始保加利亞乳酸桿菌在尿毒癥病人血清中培養(yǎng)傳代，可獲得降解肌酐，尿素氮，尿酸的能力，尿毒癥病人血清可作為誘變前定向誘導(dǎo)劑。
　　3.濃度1％硫酸二乙酯(DES)誘變處理20min，紫外燈(30W，距離30cm)照射15秒的復(fù)合誘變對(duì)乳酸菌降解肌酐能力影響效果最佳。
　　4.運(yùn)用尿毒癥病人血清定向誘導(dǎo)后經(jīng)DES-UV復(fù)合誘變的方法，成功獲得能夠高效分解多種尿毒素的保加利亞乳酸工程菌DUC3-17，能夠穩(wěn)定遺傳。對(duì)