甘露聚糖結(jié)合凝集素誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡機(jī)制的初步探索.pdf

1、MBL(mannan-binding lectin,MBL)作為天然免疫的重要分子,其與感染和免疫缺陷疾病之間的聯(lián)系一直是研究的熱點(diǎn)[1-2],也有關(guān)于MBL調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化成熟[3-5]和調(diào)節(jié)MΦ/Mo吞噬功能的報(bào)道[6]。研究發(fā)現(xiàn),甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)能結(jié)合Hela細(xì)胞表面的甘露糖受體激活下游caspase,通過級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。與MBL同屬C型凝集素超家族中

2、膠原凝集素家族成員的肺表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A和D(SP-A和SP-D)與MBL一樣具有抗感染和抵抗各種微生物的功能,SP-A和SP-D能通過Ca2+依賴/非依賴的方式促進(jìn)MΦ對早期凋亡和/或晚期凋亡細(xì)胞的吞噬[8-9]。經(jīng)典途徑重要的補(bǔ)體分子C1q在結(jié)構(gòu)上和MBL亦有許多相似之處,二者均可結(jié)合到凋亡細(xì)胞表面,促進(jìn)各種免疫細(xì)胞(MΦ,imDCs等)對凋亡細(xì)胞的吞噬[10-11],如網(wǎng)鈣蛋白(C1qR)結(jié)合CD91介導(dǎo)對整個(gè)凋亡細(xì)胞和細(xì)胞

3、碎片的吞噬,MBL還能以Ca2+依賴的方式結(jié)合微生物來源和凋亡細(xì)胞來源的DNA和RNA片段,促進(jìn)吞噬細(xì)胞對其內(nèi)吞[12]?？梢?膠原凝集素家族不少成員在細(xì)胞凋亡過程和凋亡細(xì)胞清除中起著重要作用,本科室王明永博士曾發(fā)現(xiàn)MBL對Jurkat細(xì)胞的增殖有抑制作用[13],目前關(guān)于MBL,對細(xì)胞凋亡影響的研究仍甚少。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中,我們首先從人新鮮冰凍血漿中提取獲得較高純度、無LPS且具有生物學(xué)活性的天然MBL,然后以人單核細(xì)胞系來

4、源的U937細(xì)胞為細(xì)胞模型,初步研究MBL與U937細(xì)胞的結(jié)合,MBL對其生長的影響,并對MBL促進(jìn)U937細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行初步探索。
　　 一.人血漿中MBL的純化分離與LPS去除人血漿中MBL濃度較低,正常人在40～3500μg/ml,平均約900μg/ml[14-15]。MBL的純化取決于其與甘露聚糖的Ca2+依賴性親和力。實(shí)驗(yàn)采用本科室陳月博士和王明永博士建立的配體甘露聚糖-Sepharose4B親和層析柱體系,將預(yù)處

5、理人血漿2次上柱親和層析分離,分別用Mannose、EDTA溶液洗脫結(jié)合蛋白法純化MBL[16]。
　　 脂多糖(LPS)為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分,大量文獻(xiàn)報(bào)道LPS對MΦ/Mo表型的分化和成熟均有重要影響[17-18]。我們以人單核細(xì)胞來源的U937細(xì)胞為研究對象,LPS的去除是實(shí)驗(yàn)可靠的重要基礎(chǔ)。所以我們通過去內(nèi)毒素凝膠柱去除LPS和與LPS結(jié)合的MBL,應(yīng)用鱟試劑檢測去除效果,結(jié)果證明LPS去除前后差異顯著,能夠達(dá)到

6、去除目的。為進(jìn)一步驗(yàn)證處理后的MBL符合實(shí)驗(yàn)要求,我們對蛋白的生物學(xué)活性和免疫學(xué)活性進(jìn)行了鑒定:SDS-PAGE和Westernblot表明,所得MBL為存在大量Mr>200000高聚體形式的MBL,應(yīng)具有較高活性,配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明所得MBL具有免疫學(xué)活性,甘露聚糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明所得MBL具有生物學(xué)活性,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的保證。
　　 二.MBL對U937細(xì)胞增殖和凋亡的影響近年來,有研究發(fā)現(xiàn)甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-

7、binding lectin)對Hela細(xì)胞有促凋亡的作用。SP-A,SP-D,C1q和MBL通過免疫調(diào)節(jié)作用促進(jìn)凋亡細(xì)胞被吞噬。同時(shí),我們在U937細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)高濃度MBL條件下,細(xì)胞增殖出現(xiàn)受抑。根據(jù)膠原凝集素家族各成員之間結(jié)構(gòu)和功能的同源性,我們推測MBL很有可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制其增殖。
　　 首先,我們通過細(xì)胞ELISA證實(shí)MBL與U937之間能夠相互結(jié)合,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了可靠的保證。不同濃度MBL培養(yǎng)細(xì)胞

8、后加入CCK-8試劑,37℃培養(yǎng)箱反應(yīng)2h后檢測A450nm值。同樣的方法處理細(xì)胞(時(shí)效和量效)后用Hochest33258對細(xì)胞核進(jìn)行染色,觀察細(xì)胞的核結(jié)構(gòu)是否完整。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FICT/PI雙染法(時(shí)效和量效)對細(xì)胞的早、中晚期凋亡率進(jìn)行定量。通過DNA ladder電泳鑒定引起細(xì)胞死亡的是壞死還是凋亡。
　　 CCK-8結(jié)果顯示,30～50μg/ml MBL作用U937細(xì)胞72h時(shí),細(xì)胞增殖明顯受抑,

9、而低濃度組(10～20μg/ml)無細(xì)胞增殖受抑現(xiàn)象,細(xì)胞甚至出現(xiàn)劑量依賴性的增殖,我們推測MBL對U937細(xì)胞的作用很有可能并不是單一的、單向的。Hoechst33258和Annexin V/PI的結(jié)果表明高濃度MBL培養(yǎng)細(xì)胞72h,細(xì)胞不僅出現(xiàn)了增殖受抑且細(xì)胞膜的完整性被破壞,已發(fā)生凋亡:細(xì)胞核由染色均一出現(xiàn)染色質(zhì)染色不均、核固縮及核碎裂,細(xì)胞凋亡率隨MBL濃度的增加、作用時(shí)間的延長而上升。光鏡下,對照組細(xì)胞培養(yǎng)54h后大量增殖并出

10、現(xiàn)成團(tuán)現(xiàn)象,MBL50μg/ml組細(xì)胞數(shù)量明顯低于對照組,且狀態(tài)欠佳。通過DNA ladder電泳染色體的片段化確證了引起細(xì)胞死亡的是凋亡而非壞死。總之,30μg/ml～50μg/ml MBL作用于U937細(xì)胞72h時(shí)能夠促進(jìn)其凋亡,且具有濃度依賴性,但其機(jī)制需要進(jìn)一步的探討。
　　 三.MBL促進(jìn)U937細(xì)胞凋亡機(jī)制的探討細(xì)胞凋亡是一種受基因控制的自主性死亡,有賴于新的RNA和蛋白質(zhì)的合成。凋亡有三條途徑:死亡受體途徑、線粒體

11、途徑和CTL介導(dǎo)的顆粒酶途徑。死亡受體途徑通過死亡受體(Fas、TNFR1等)與相應(yīng)配體(FasL、TNF等)結(jié)合能招募FADD;線粒體途徑通過抗凋亡成員(Bcl-2、Bcl-XL)和促凋亡成員(Bax、Bid)調(diào)控線粒體膜對細(xì)胞色素C的通透性。二者最終激活Caspase-3而切割胞內(nèi)底物、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝,導(dǎo)致凋亡的生化和形態(tài)學(xué)變化。
　　 為探索MBL導(dǎo)致U937細(xì)胞凋亡的可能途徑和機(jī)制,我們欲通過Realtime-PCR

12、和WB對參與凋亡過程的各基因和蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。不同濃度MBL(0,30,50μg/ml)培養(yǎng)U937細(xì)胞,72h后裂解細(xì)胞收集蛋白或提取細(xì)胞總RNA,然后通過Western Blot和Real time-PCR對各組蛋白和基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,MBL組Fas和Caspase-3基因表達(dá)量上升,而Bcl-2和Bax基因表達(dá)量無顯著變化,Fas和FasL蛋白表達(dá)量上升,凋亡執(zhí)行者Caspase-3被剪切激活,而和參與DNA損傷