甘露聚糖結(jié)合凝集素調(diào)節(jié)THP1-CD14細(xì)胞細(xì)胞因子分泌機(jī)制的初步探索.pdf

1、盡管近年來天然免疫研究進(jìn)展十分迅速，但是天然免疫的本質(zhì)亟待揭示和闡明。隨著JanewayCAJr等提出天然免疫通過模式識(shí)別作用啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答并左右其應(yīng)答類型的假說，模式識(shí)別分子成為了免疫學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。模式識(shí)別分子是天然免疫的重要分子，根據(jù)其存在的形式，可分為可溶性和細(xì)胞膜表面兩大類。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，膜相模式識(shí)別受體中Toll樣受體家族(Toll-likereceptors，TLR)、巨噬細(xì)胞甘露糖受體(macrophagemannos

2、erecetor，MR)和可溶性模式識(shí)別分子中的膠凝素(collectins)家族成員肺表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A和D(surfactantproteinA、surfactantproteinD，SP-A、SP-D)等是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁。天然免疫模式識(shí)別作用正直逼免疫應(yīng)答的核心問題--應(yīng)答的啟動(dòng)及其調(diào)控。 甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-bindinglectin，MBL)與SP-A、SP-D同屬于膠凝素家族，主要

3、由肝細(xì)胞分泌，作為糖蛋白存在于血漿中。MBL的一級(jí)結(jié)構(gòu)至高級(jí)結(jié)構(gòu)均與補(bǔ)體分子C1q高度同源。MBL的主要功能區(qū)有二，即糖識(shí)別域(carbohydrate-recognitiondomain，CRD)和膠原樣區(qū)(collagen-likeregion，CLR)。前者是識(shí)別功能區(qū)，能以Ca2+依賴方式識(shí)別多種病原體表面的糖結(jié)構(gòu)。后者為效應(yīng)功能區(qū)，與2個(gè)MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MBLassociatedserineprotease，MASP-

4、1，MASP-2)結(jié)合而激活補(bǔ)體凝集素途徑，在天然免疫中發(fā)揮防御作用，這是MBL作為補(bǔ)體成分的作用。近年來，對(duì)MBL的免疫調(diào)節(jié)作用亦有一些報(bào)道。國外相關(guān)研究表明，MBL，可抑制DC-SIGN介導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答，調(diào)節(jié)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmonoeuclearcell，PBMC)分泌細(xì)胞因子。本課題組以前的工作也發(fā)現(xiàn)MBL具有免疫調(diào)節(jié)作用：能抑制LPS刺激DC功能的成熟，抑制LPS刺激不同分化和活化狀態(tài)的人單核細(xì)胞

5、系THP1／CD14細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-12。然而，有關(guān)MBL免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。 本研究中，我們以人單核細(xì)胞系THP1／CD14為細(xì)胞模型，初步研究了MBL與THP1／CD14細(xì)胞的結(jié)合、結(jié)合的特性和MBL與TLR的相互作用。 一、MBL與人單核細(xì)胞系THP1／CD14細(xì)胞結(jié)合 采用Cell-ELISA和流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)MBL是否與THP1／CD14細(xì)胞結(jié)合進(jìn)行了研究。Cell-E

6、LISA結(jié)果顯示，MBL能以濃度依賴方式與THP1／CD14細(xì)胞結(jié)合。以流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在無Ca2+存在的或以EDTA取代CaCl2的結(jié)合緩沖液中，MBL與THP1／CD14細(xì)胞幾乎不結(jié)合；而在含5mmol／L或10mmol／LCaCl2的結(jié)合緩沖液中，MBL與THP1／CD14細(xì)胞可以結(jié)合，且在含10mmol／LCaCl2的結(jié)合緩沖液中結(jié)合能力比較強(qiáng)，提示二者的結(jié)合呈Ca2+濃度依賴關(guān)系。結(jié)果表明，從血漿天然MBL在生理?xiàng)l件下確實(shí)

7、可以結(jié)合THP1／CD14細(xì)胞，且這種結(jié)合具有Ca2+濃度依賴性，提示THP1／CD14細(xì)胞上可能存在MBL的受體或結(jié)合蛋白，且二者結(jié)合需要Ca2+參與。 二、MBL與THP1／CD14細(xì)胞結(jié)合特性的研究 一般認(rèn)為，MBL可結(jié)合單核巨噬細(xì)胞表面的膠凝素受體即C1q受體(C1qrecepror，C1qR)。然而，根據(jù)上述結(jié)果，我們推測MBL可能通過其CRD與細(xì)胞表面某些糖蛋白或其他糖結(jié)構(gòu)結(jié)合。本課題組已分段表達(dá)了重組人MB

8、L的CLR(rhMBL-CLR)和CRD(rhMBL-CRD)蛋白，建立了分泌抗人C1qR單克隆抗體(monoclonalantibody，mAb)的雜交瘤E8，為本部分的實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先制備了抗人C1qRmAbE8、rhMBL-CLR和rhMBL-CRD蛋白，然后采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MBL結(jié)合THP1／CD14細(xì)胞的功能區(qū)進(jìn)行了研究，檢測了多種糖、rhMBL-CRD、rhMBL-CLR、C1q和E8對(duì)THP1／CD14

9、細(xì)胞與MBL結(jié)合的抑制作用。結(jié)果顯示，THP1／CD14細(xì)胞與MBL的結(jié)合能被某些糖抑制；rhMBL-CRD、rhMBL-CLR蛋白單獨(dú)能部分抑制其結(jié)合，兩者聯(lián)合則可達(dá)完全抑制效果；但C1q和E8無抑制作用。資料表明，THP1／CD14細(xì)胞表達(dá)糖敏感的MBL受體或結(jié)合蛋白，包括對(duì)CLR和CRD特異的兩種受體，均與C1qR無關(guān)；MBL可能以一種以上的方式結(jié)合THP1／CD14細(xì)胞。 三、MBL與TLR關(guān)系的初步研究 TLR

10、-2是人類TLR家族成員中表達(dá)范圍最廣泛，識(shí)別病原微生物及其產(chǎn)物種類最多的分子，也是單核巨噬細(xì)胞主要表達(dá)的TLR之一。本部分研究中，我們首先采用ELISA、Westernblot對(duì)TLR-2能否直接與MBL結(jié)合進(jìn)行了分析，結(jié)果表明MBL能直接結(jié)合真核表達(dá)的重組TLR-2胞外段蛋白。對(duì)LPS刺激THP1／CD14細(xì)胞結(jié)合MBL的情況進(jìn)行研究，ELISA結(jié)果顯示，MBL與100ng／LLPS刺激的THP1／CD14細(xì)胞結(jié)合能力比無LPS刺激

11、者強(qiáng)，且sTLR-2蛋白可部分抑制這種結(jié)合;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果同樣表明，LPS刺激的THP1／CD14細(xì)胞的MBL結(jié)合能力增強(qiáng)，且具有LPS濃度依賴性，隨著LPS濃度增高，結(jié)合逐漸加強(qiáng)。然后，我們采用RT-PCR分析了LPS刺激對(duì)細(xì)胞TLR-2、TLR-4mRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)LPS刺激2h后THP1／CD14細(xì)胞TLR-2、TLR-4mRNA表達(dá)水平增高；24h后有所下降，接近與未刺激時(shí)水平。最后，提取未刺激的、LPS刺激的和MBL加L

12、PS共同刺激的THP1／CD14細(xì)胞的核蛋白，采用Westernbolt方法分析和轉(zhuǎn)錄因子NF-KB的轉(zhuǎn)位，發(fā)現(xiàn)MBL可抑制LPS誘導(dǎo)NF-KB轉(zhuǎn)位，表明MBL調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌的機(jī)制可能與抑制NF-kB轉(zhuǎn)位有關(guān)。 上述研究結(jié)果表明，THP1／CD14細(xì)胞表達(dá)Ca2+依賴性、糖敏感的MBL受體或結(jié)合蛋白，包括對(duì)CLR和CRD特異的兩種受體，均與C1qR無關(guān)。MBL可與TLR-2胞外段結(jié)合；LPS刺激后的THP1／CD14細(xì)胞結(jié)合M

13、BL能力增強(qiáng)，這與LPS刺激THP1／CD14細(xì)胞TLR-2和TLR-4的mRNA表達(dá)增高是一致的；MBL與THP1／CD14細(xì)胞的結(jié)合能被sTLR-2蛋白部分抑制；MBL可抑制LPS誘導(dǎo)THP1／CD14細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的轉(zhuǎn)位。因此提出，MBL抑制LPS刺激THP1／CD14細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子可能與兩方面的機(jī)制有關(guān)：①THP1／CD14細(xì)胞在LPS刺激下TLR2和TLR4表達(dá)量增加，導(dǎo)致其與MBL的結(jié)合力增強(qiáng)、結(jié)合量增多；②