甘露聚糖結(jié)合凝集素對人中性粒細(xì)胞功能的影響.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)是抵御病原微生物感染的第一道防線，其主要由參與天然免疫的效應(yīng)分子和效應(yīng)細(xì)胞構(gòu)成。常見的效應(yīng)分子有防御素、補體系統(tǒng)、細(xì)胞因子和溶菌酶等;效應(yīng)細(xì)胞有吞噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等。天然免疫的識別機制是由多種識別分子及效應(yīng)分子組成的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其可通過模式識別受體(paternrecognition receptor，PRR)如甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)、肽聚糖識別蛋白、Toll樣受體(To

2、ll-like receptor，TLR)等識別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)識別相關(guān)的病原微生物而發(fā)揮作用，參與機體的免疫調(diào)節(jié)。MBL為肝臟合成的血漿蛋白，是天然免疫補體系統(tǒng)中啟動凝集素途徑的關(guān)鍵蛋白。MBL是一種分泌型PRR，是C型凝集素超家族中膠凝素(collectins)家族的一員。MBL可選擇性識別多種病原體表面的糖結(jié)構(gòu)，可通過凝集素途徑以不依賴抗體和C

3、1q的方式激活補體，從而介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用及發(fā)揮溶破和間接調(diào)理功能，并能與吞噬細(xì)胞表面膠凝素受體結(jié)合而直接介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用，還能清除免疫復(fù)合物和凋亡細(xì)胞。正常人血漿中的MBL水平在40-5000μg/L之間，但是作為一種急性期反應(yīng)蛋白，在應(yīng)激（如病原體感染、外科手術(shù)等）時，其血漿濃度可升高2～3倍。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，膠凝素家族的其他成員如肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A和D(surfactant Protein A、surfactant protein

4、D，SP-A、SP-D)、補體C1q等具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，如SP-A能夠抑制DC的成熟和分化;Fraser等發(fā)現(xiàn)MBL能夠抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞分泌TNF-α等細(xì)胞因子。而目前國內(nèi)外關(guān)于MBL對中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）功能的影響報道較少，因此有必要深入探討。本文利用人PMN為細(xì)胞模型，研究了有無MBL缺陷人血清條件下MBL對P

5、MN功能的影響，及在白色念珠菌刺激下對PMN功能的影響。本研究分為三個部分：
　　 第一章：人天然MBL的提取與純化。MBL是肝細(xì)胞分泌的血漿蛋白，是天然免疫系統(tǒng)中一個關(guān)鍵的可溶性模式識別受體。正常人血漿中MBL含量較低，約10～5000μg/L，平均約為1200μg/L?；诒究剖业拈L期工作基礎(chǔ)，已經(jīng)建立了對人天然MBL分離純化的方法。因有文獻(xiàn)報道熱原及血漿中IgG有可能干擾實驗，因此在本研究中，我們通過甘露聚糖-Sephar

6、ose4B親和層析體系，分離得到粗提MBL，經(jīng)LC柱和多粘菌素B凝膠柱去除IgG與LPS，最后得到無熱源的人天然MBL蛋白。通過SDS-PAGE和Western blot檢測純化MBL的純度及存在形式;同時應(yīng)用配體結(jié)合實驗鑒定MBL的活性。同時SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示純化得到的MBL主要以高聚體的形式（分子量＞200 KD）存在，雜蛋白IgG得到明顯的去除;同時鱟試劑檢測表明，經(jīng)過多粘菌素B凝膠柱純化后的MBL

7、中殘余的LPS量符合無熱源要求;并通過配體結(jié)合實驗證實所得的MBL仍保持良好的結(jié)合活性，為后續(xù)的實驗開展提供可靠的保證。
　　 第二章：存在補體時MBL對人PMN功能的影響。PMN作為天然免疫中重要的吞噬細(xì)胞，在抗病原微生物感染中起著重要作用。其在炎癥局部促炎因子和趨化因子的作用下，可快速遷移到炎癥部位并通過釋放炎性細(xì)胞因子、活性氧及脫顆粒等發(fā)揮抗感染作用。PMN作為人體數(shù)量最多的吞噬細(xì)胞，在天然免疫防御中發(fā)揮著極其重要的意義;

8、但在免疫調(diào)節(jié)紊亂的情況下，PMN可能加重炎癥反應(yīng)從而使機體產(chǎn)生嚴(yán)重的損害，因此對PMN功能調(diào)節(jié)的研究顯得尤為重要。由于MBL也是天然免疫系統(tǒng)重要的效應(yīng)分子，因此我們研究MBL對PMN功能的影響。我們采用ELISA和Dot blot法檢測MBL與微生物的結(jié)合;以ELISA檢測MBL對PMN分泌TNF-α和IL-6的影響;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測及熒光顯微鏡觀察MBL對PMN吞噬功能的影響;qPCR分析MBL對PMN表達(dá)IL-1β，TNF-α和C

9、D11b的影響;應(yīng)用NBT法檢測MBL對PMN呼吸爆發(fā)的影響。ELISA和Dot bolt結(jié)果顯示MBL與微生物結(jié)合并呈濃度依賴關(guān)系;存在MBL缺陷人血清時，MBL促進(jìn)PMN對白色念珠菌(Candidaalbicans，C.albicans)吞噬，且可被Mannan阻斷，但對吞噬大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)無明顯差別;qPCR結(jié)果顯示:與空白組相比，MBL組PMN表達(dá)IL-1β，TNF-α及CD11b的水平增

10、高;同時ELISA結(jié)果顯MBL組對比空白組TNF-α和IL-6分泌增加;NBT結(jié)果顯示，MBL組呼吸爆發(fā)程度高于對照組。以上結(jié)果提示MBL能促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌，增強PMN吞噬功能。
　　 第三章：無補體存在時MBL對PMN功能的影響。MBL的糖識別域(carbohydrate-recognition domain，CRD)可識別病原微生物表面的糖結(jié)構(gòu)，并通過其CLR與吞噬細(xì)胞表面膠凝素受體結(jié)合，以不依賴補體系統(tǒng)，而發(fā)揮直接調(diào)理

11、功能和MBL依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。因此我們研究了無補體存在時MBL對PMN功能的影響。通過ELISA法檢測MBL對PMN分泌TNF-α和IL-6的影響;應(yīng)用qPCR檢測MBL對PMN表達(dá)IL-1β，TNF-α及IL-6及相關(guān)凋亡基因mRNA的影響;采用NBT法檢測MBL對PMN呼吸爆發(fā)的影響;應(yīng)用hoechst檢測MBL對PMN凋亡的影響。ELISA結(jié)果顯示，C.albicans刺激PMN時，低劑量的MBL(2.5μg/ml)可顯

12、著促進(jìn)PMN分泌TNF-α和IL-6，而較高劑量的MBL(20μg/ml)對比低劑量的MBL(2.5μg/ml)，TNF-α的分泌受到顯著的抑制，同時抑制作用可被Mannan所阻斷;qPCR檢測TNF-α和IL-6 mRNA的結(jié)果也與ELISA結(jié)果相似;LPS刺激PMN時，ELISA和qPCR結(jié)果顯示高濃度的MBL可抑制TNF-α的分泌;Hoechst檢測結(jié)果顯示高濃度MBL處理后PMN核質(zhì)染色高亮點明顯增多對比空白組;qPCR檢測結(jié)果

13、顯示高濃度的MBL可上調(diào)Caspase-3和Fas的表達(dá)。以上結(jié)果顯示在白色念珠菌存在時，MBL可能具有雙重免疫功能，提示MBL對機體的炎癥應(yīng)答的調(diào)節(jié)起重要作用。綜上所述，我們利用純化人天然MBL研究了MBL對PMN功能的影響，結(jié)果提示MBL的作用可能受到效應(yīng)細(xì)胞的狀態(tài)和微環(huán)境的影響而有所不同。在無病原體條件下，MBL的作用以促炎為主;而在C.albicans和LPS刺激下，MBL的作用具有雙重性，低劑量促炎，而高劑量則抑制炎性因子的表