甘露聚糖結(jié)合凝集素對(duì)抗原提呈細(xì)胞分化與功能的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、該文首先建立了一種比較簡(jiǎn)便的同時(shí)分離純化MBL和MASP酶原的方法，從人新鮮冰凍血漿中提取獲得高純度的具有生物學(xué)活性的天然MBL。在此基礎(chǔ)上，分別探討了體外用MBL誘導(dǎo)人單核細(xì)胞(monocyte，Mo)向DC分化成熟的可能性及其對(duì)Mo來(lái)源的DC(monocyte-deriveddendriticcells，MoDC)功能的影響；研究了MBL對(duì)LPS誘導(dǎo)的MoDC成熟、細(xì)胞因子釋放、吞噬能力及T細(xì)胞活化能力的調(diào)節(jié)作用以及對(duì)LPS刺激的不

2、同分化和活化狀態(tài)THP1/CD14細(xì)胞分泌TNF-α和IL-12的影響。旨在以天然免疫模式識(shí)別作為切入點(diǎn)，探索MBL/膠凝素受體介導(dǎo)抗原攝取、加工、提呈及誘導(dǎo)共刺激分子和細(xì)胞因子表達(dá)的情況，從一個(gè)方面闡述免疫信息從天然免疫系統(tǒng)向獲得性免疫系統(tǒng)傳遞、從而啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答并左右應(yīng)答類(lèi)型的途徑與機(jī)制。 一、人血漿中MBL-MASP復(fù)合物的純化與初步分離 該研究根據(jù)MBL可結(jié)合非活化Sepharose4B的特點(diǎn)，先用非活化Se

3、pharose4B兩步親和層析從人新鮮冰凍血漿中純化MBL-MASP復(fù)合物，再以SephacrylS-300柱凝膠過(guò)濾將MBL和MASP分離。在純化MBL-MASP復(fù)合物的整個(gè)過(guò)程中，除凝膠過(guò)濾緩沖液外，均加入絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲磺酰氟(PMSF)和金屬蛋白酶抑制劑1,10-鄰二氮雜菲(1，10-phenanthroline)，并控制溫度在4℃、pH7.8或pH5.0的條件下。通過(guò)這一過(guò)程，獲得了高度純化的人天然MBL和酶原形式的MA

4、SP。SDS-PAGE和Westernblot分析表明，所純化的MBL為28KD和32KD肽鏈構(gòu)成的功能性多聚體；配體結(jié)合測(cè)定和酵母菌凝集試驗(yàn)證實(shí)，所純化的MBL具有配體識(shí)別活性；鑒定分離產(chǎn)物的補(bǔ)體激活活性，發(fā)現(xiàn)甘露聚糖-MBL-MASP復(fù)合物能激活補(bǔ)體系統(tǒng)，而甘露聚糖-MBL復(fù)合物則否，表明所純化的MBL-MASP是活性復(fù)合物，而通過(guò)SephacrylS-300凝膠過(guò)濾后，MBL與MASP酶原被完全分離。從而建立了一種比較簡(jiǎn)便的同時(shí)分

5、離純化MBL和MASP酶原的方法，同時(shí)還解決了配體親和純化MBL被抗糖類(lèi)抗體污染的問(wèn)題，且降低了分離純化MBL的成本。 二、MBL對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞體外分化成熟的影響 首先采用密度梯度離心法自成年健康自愿者外周血分離單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)，然后在37℃、50ml/LCO2條件下，于含100ml/L新生牛血清(newborncalfserum，NCS)的RPMI1

6、640中貼壁粘附3h，棄去懸浮細(xì)胞，獲得粘附細(xì)胞即為Mo，將其在含rhGM-CSF和rhIL-4的IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d，然后在有或無(wú)rhTNF-α或天然人MBL的情況下繼續(xù)培養(yǎng)2d。于倒置顯微鏡下觀察DC的形態(tài)，用FACS分析DC表面分子CD1a、CD83、CD40、CD80、CD86和MHC-DR的表達(dá)，以3H-TdR摻入法測(cè)定DC刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力，用酵母多糖顆粒吞噬試驗(yàn)評(píng)估DC的抗原攝取能力，以ELISA技術(shù)檢測(cè)DC

7、培養(yǎng)上清中IL-12和TNF-α的含量。結(jié)果顯示，GM-CSF+IL-4不能誘導(dǎo)DC完全成熟和活化，誘導(dǎo)7d后CD83表達(dá)平均只有22.73％，但該體系有利于DC擴(kuò)增；MBL刺激的DC表面分子CD1a、CD83、CD40、CD80、CD86和MHC-DR的表達(dá)均上調(diào)，攝取酵母多糖顆粒的能力降低，激發(fā)初始T細(xì)胞增殖的能力加強(qiáng)，分泌的IL-12增多但幾乎不分泌TNF-α。資料表明，MBL能夠誘導(dǎo)DC分化成熟，提示其可能通過(guò)調(diào)節(jié)DC的功能而參

8、與獲得性免疫應(yīng)答，但其機(jī)理尚需進(jìn)一步探討。 三、MBL對(duì)LPS誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的調(diào)節(jié)作用 LPS是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，其引發(fā)疾病包括敗血癥或感染性休克是臨床常見(jiàn)的危急病癥，常導(dǎo)致病人死亡。研究證明，LPS是人DC成熟和存活的強(qiáng)力刺激劑，能在體內(nèi)外充分激活DC。DC是最強(qiáng)力的APC，而調(diào)控DC的成熟與活性可能提供防治LPS有關(guān)炎癥性疾病的新策略。MBL與SP-A和SP-D同屬于C型凝集素超家族中膠凝素家族的成員。己

9、發(fā)現(xiàn)SP-A通過(guò)與CD14相互作用調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答，SP-D結(jié)合CD14并改變CD14-LPS相互作用。然而，MBL是否通過(guò)與CD14相互作用改變LPS刺激產(chǎn)生的細(xì)胞應(yīng)答還有待研究。因此，研究中，該文探討了在體外MBL對(duì)LPS誘導(dǎo)人MoDC成熟、細(xì)胞因子釋放、吞噬能力及T細(xì)胞活化能力的影響。 首先從健康成人外周血分離能粘附塑料的Mo，在rhGM-CSF和rhIL-4條件下培養(yǎng)5d，然后在有或無(wú)LPS和不同濃度(10～10

10、0mg/L)天然人MBL條件下繼續(xù)培養(yǎng)2d。用倒置顯微鏡觀察DC的形態(tài)，以FACS分析DC的表型，用MTT法測(cè)定DC刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力，以酵母多糖顆粒吞噬試驗(yàn)評(píng)估DC的抗原攝取能力，用ELISA檢測(cè)DC培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-12p40+p70的含量。結(jié)果顯示，MBL以劑量依賴(lài)方式下調(diào)LPS誘導(dǎo)的人MoDC表面分子CD83和CD86表達(dá)，增強(qiáng)其攝取酵母多糖顆粒的能力，降低其激發(fā)初始T細(xì)胞增殖的能力，并抑制其LPS誘導(dǎo)的TN

11、F-α和IL-12p40+p70分泌，但MBL濃度低至10mg/L時(shí)對(duì)LPS誘導(dǎo)DC成熟作用幾無(wú)影響。該研究表明高濃度MBL能抑制LPS誘導(dǎo)的DC成熟過(guò)程，提示其可能在LPS引發(fā)疾病包括敗血癥或感染性休克中具有調(diào)節(jié)作用，通過(guò)抑制致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生有效地防止LPS誘導(dǎo)的致死性?xún)?nèi)毒素血癥，有利于宿主抵抗革蘭氏陰性菌急性感染，作為細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑可能對(duì)感染性休克的發(fā)生、發(fā)展具有一定的調(diào)控作用。此研究結(jié)果提供了應(yīng)用MBL在DC過(guò)度活化情況下治療作用

12、的理Ⅳ論基礎(chǔ)，可能發(fā)展為通過(guò)調(diào)控DC的分化成熟和活性而治療感染性休克的一種新方法，同時(shí)還提供了分析DC分化成熟有關(guān)信號(hào)途徑的新手段。然而，正常人血清中MBL濃度很低，故上述結(jié)果在生理狀態(tài)下的意義尚待進(jìn)一步探討。 四、MBL對(duì)LPS誘導(dǎo)不同分化和活化狀態(tài)的THP1/CD14細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-12的影響 前文報(bào)道高濃度的MBL下調(diào)LPS誘導(dǎo)DC分泌致炎細(xì)胞因子TNE-α和IL-12，提示MBL可能提供了一個(gè)抑制LPS

13、刺激產(chǎn)生過(guò)量成熟DC和調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答的信號(hào)。然而，DC培養(yǎng)過(guò)程復(fù)雜，需添加的細(xì)胞因子價(jià)格昂貴，DC的鑒定也有一定困難，且依所用培養(yǎng)基和細(xì)胞因子等條件，人Mo可分化為功能完全不同的細(xì)胞。因此，該文選用一種轉(zhuǎn)染了LPS受體CD14即組成性表達(dá)CD14的前單核細(xì)胞系THP1/CD14細(xì)胞進(jìn)行研究。采用RT-PCR和ELISA技術(shù)，分別從mRNA水平和蛋白水平探討MBL對(duì)LPS誘導(dǎo)不同分化和活化狀態(tài)的THP1/CD14細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和I

14、L-12的影響，為更方便地進(jìn)一步剖析MBL在獲得性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中的作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 以含100ml/LNCS的IMDM培養(yǎng)THP1/CD14細(xì)胞，在PMA和/或IFN-γ存在條件下誘導(dǎo)出不同分化和活化狀態(tài)的Mo，以不同濃度(1～100mg/L)天然人MBL預(yù)處理2h，然后用LPS(1mg/L)刺激24h。收集細(xì)胞，分離mRNA，以半定量RT-PCR從mRNA水平評(píng)估TNF-α和IL-12的表達(dá)。收集培養(yǎng)上清，用ELISA從

15、蛋白水平檢測(cè)其中TNE-α和IL-12p40+p70的含量。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明：LPS可刺激各組細(xì)胞分泌TNF-α和IL-12p40+p70；IFN-γ活化的THP1/CD14細(xì)胞產(chǎn)生IL-12p40+p70最高，PMA分化的THP1/CD14細(xì)胞最低；PMA分化和IFN-γ化的THP1/CD14細(xì)胞分泌TNF-α最高，未用PMA或IFN-γ預(yù)處理的THP1/CD14細(xì)胞最低；雖然低濃度(1～10mg/L)MBL幾乎不影響LPS誘導(dǎo)

16、細(xì)胞分泌TNF-α和IL-12p40+p70的作用，但高濃度MBL顯著降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-12p40+p70的分泌量。RT-PCR分析亦顯示，與相應(yīng)只用LPS刺激的實(shí)驗(yàn)組相比，高濃度(50mg/L)MBL預(yù)處理的細(xì)胞TNF-α、IL-12p35和p40mRNA表達(dá)均有不同程度的降低。研究表明，MBL與CD14相互作用抑制LPS誘導(dǎo)不同分化和活化狀態(tài)的THP1/CD14細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-12，提示與CD14相互作用可

17、能是膠原凝集素家族的一個(gè)共性。MBL對(duì)LPS誘導(dǎo)THP1/CD14細(xì)胞分泌TNF-α和IL-12蛋白的影響與對(duì)其mRNA表達(dá)的影響相應(yīng)，表明在mRNA表達(dá)和翻譯之間可能并無(wú)特別的調(diào)節(jié)步驟。IFN-γ既可增強(qiáng)LPSⅤ誘導(dǎo)的THP1/CD14細(xì)胞產(chǎn)生IL-12，又可促進(jìn)LPS刺激PMA分化的THP1/CD14細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-12。因此，THP1/CD14是一很好的細(xì)胞模型，可用以進(jìn)一步剖析MBL在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)相關(guān)信號(hào)

18、途徑中的作用機(jī)理。上述研究結(jié)果顯示，MBL可能通過(guò)調(diào)節(jié)APC的功能而參與獲得性免疫應(yīng)答，通過(guò)與CD14相互作用影響細(xì)菌成分誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答并調(diào)控細(xì)胞因子分泌。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)與之類(lèi)似的報(bào)道，盡管其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究加以闡明。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探索MBL參與獲得性免疫應(yīng)答的作用及其機(jī)制提供了新的切入點(diǎn)，后續(xù)MBL免疫調(diào)節(jié)作用的特性分析、分子機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)途徑的闡明，將進(jìn)一步揭示MBL這種重要天然免疫分子的生物學(xué)意義。