EphB4通過骨膜蛋白促進CTLA4修飾的MSCs有效成骨的機制研究.pdf

1、目的：
　　本次研究通過利用CTLA4修飾的MSCs來構建TEB，一方面采用不同的動物移植模型來驗證成骨修復效果，另一方面在體外利用免疫激活共培養(yǎng)體系驗證其對于MSCs-CTLA4中EphB4和POSTN表達的影響，并揭示EphB4與POSTN之間的關系，最后探索EphB4通過POSTN促進MSCs-CTLA4成骨分化的機制，旨在為進一步闡明MSCs-CTLA4在異體移植中有效成骨的具體機制提供理論依據。
　　第一部分 Ep

2、hB4在CTLA4修飾的MSCs異位成骨中的作用
　　方法：
　　1.密度梯度離心法分離MSCs，采用DBM雙面接種法構建TEB，然后將TEB置于成骨誘導培養(yǎng)基中誘導14天。在植入小鼠體內前更換常規(guī)培養(yǎng)基，利用CTLA4腺病毒載體進行感染，構建表達CTLA4的TEB。
　　2.建立小鼠股骨旁TEB異位移植模型，Micro-CT分析異位成骨情況。后續(xù)制備移植區(qū)域組織切片，HE及Masson染色觀察組織形態(tài)，免疫組化染色觀

3、察CTLA4及EphB4的表達情況。
　　3.體外利用植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)刺激外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)來建立免疫激活微環(huán)境，然后將MSCs或MSCs-CTLA4置于其中共培養(yǎng)，建立免疫激活共培養(yǎng)體系。
　　4.ELISA測定共培養(yǎng)體系中IL-2和IFN-γ的表達情況。Q-PCR和Western blotting實驗

4、測定免疫激活共培養(yǎng)前后MSCs及MSCs-CTLA4中EphB4的表達情況。
　　5.ephrinB2-FC激活EphB4后，利用Q-PCR、免疫熒光、特殊染色法測定相關成骨標志物表達情況。
　　6.為了探索EphB4促進MSCs成骨分化的具體機制，構建了EphB4過表達及siRNA載體作為對照組，利用Western blotting實驗測定EphB4激活后相應信號蛋白的表達情況。
　　結果：
　　1.普通光鏡觀

5、察結果顯示，接種了MSCs的DBM可見細胞形成膜樣結構并附著于DBM支架上;熒光顯微鏡觀察結果顯示在MSCs-CTLA4構建的DBM中可見細胞發(fā)出綠色熒光，證明攜帶CTLA4基因的腺病毒感染TEB成功。
　　2.小鼠股骨旁TEB異位移植區(qū)組織切片中，免疫組化測定CTLA4的陽性表達僅在DBM+MSCs-CTLA4組中可見，其余組均為陰性染色。免疫熒光染色結果顯示EphB4在DBM+MSCs-CTLA4組中的表達量顯著高于其余組。H

6、E、Masson染色和Micro-CT三維重建結果均顯示相對于其他組，DBM+MSCs-CTLA4組中可見明顯的新生骨組織區(qū)。相關骨生成數據分析結果顯示DBM+MSCs-CTLA4組在新生骨量與骨體積比(BV/TV)，骨小梁數量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)中顯著高于其余三組，而在骨小梁分離度(Tb.Sp)中顯著低于其余三組(P＜0.05)。
　　3.未激活狀態(tài)下的PBMCs在培養(yǎng)基中呈分散排布，當加入PHA刺激后，PBM

7、Cs中的T淋巴細胞母細胞化，成團聚集在一起。光鏡下顯示MSCs-CTLA4共培養(yǎng)組中PBMCs的聚集程度顯著低于MSCs共培養(yǎng)組。ELISA檢測結果顯示IL-2和IFN-γ在MSCs-CTLA4共培養(yǎng)組中的表達水平顯著低于MSCs共培養(yǎng)組(P＜0.05)。
　　4.Western blotting結果顯示在免疫激活微環(huán)境中，EphB4在MSCs中的表達水平顯著下調，而在MSCs-CTLA4中則維持了正常水平，Q-PCR結果趨勢與其

8、一致(P＜0.05)。
　　第二部分 EphB4信號上調MSCs中骨膜蛋白的表達
　　方法：
　　1.制作小鼠股骨旁TEB異位移植區(qū)組織切片，免疫組化測定POSTN表達情況。
　　2.免疫細胞化學測定POSTN在MSCs中表達定位情況，同時Western blotting、Q-PCR、ELISA測定EphB4激活后POSTN的蛋白、基因表達及體外分泌情況。
　　3.利用NVP-BHG-712、Integri

9、nαvβ3封閉抗體、EphB4過表達及siRNA載體來設立對照組，Q-PCR及特殊染色法檢測EphB4激活后各組細胞的成骨分化情況，Western blotting檢測相關信號分子表達情況。
　　結果：
　　1.免疫組化染色結果顯示MSCs-CTLA4組中POSTN的染色顯著強于其余組，IOD分析結果與肉眼觀察一致(P＜0.05)。
　　2.免疫細胞化學染色結果顯示POSTN定位于MSCs胞質中。各組經ephrinB2

10、-FC刺激后，MSCs組和EphB4過表達組中POSTN的蛋白，mRNA和培養(yǎng)基中的蛋白分泌水平都顯著高于其余組(P＜0.05)，而EphB4-siRNA組和NVP-BHG-712組則與空白組表達水平相近。
　　3.Q-PCR結果顯示Runx2、Osterix、COL1和ALP的mRNA水平在ephrinB2-FC刺激組、EphB4過表達組和POSTN刺激組中都有明顯增高(P＜0.05)，而在BHG712阻斷劑組、Integrin

11、αvβ3封閉組和EphB4-siRNA組中上調趨勢不明顯。ALP及茜素紅染色及IOD分析結果與上述各成骨標志物的mRNA表達趨勢一致。Western blotting結果顯示MSCs在ephrinB2-FC刺激下，單純刺激組和EphB4過表達組GSK-3β的磷酸化水平均增高，伴隨β-catenin、Runx2和COL1的表達增高，而EphB4-siRNA組、Integrinαvβ3封閉組和BHG712阻斷劑組未觀察到此現象。
　　

12、第三部分 骨膜蛋白在CTLA4修飾的MSCs成骨修復中的作用及機制研究
　　方法：
　　1.建立兔橈骨缺損TEB原位移植模型，X-ray及Micro-CT分析成骨修復情況。后續(xù)制備移植區(qū)域組織切片，HE及Masson染色觀察組織形態(tài)，免疫組化染色觀察POSTN及β-catenin的表達情況。
　　2.免疫細胞化學測定POSTN在MSCs中表達定位情況，Q-PCR和Western blotting實驗測定免疫激活共培養(yǎng)前

13、后MSCs及MSCs-CTLA4中POSTN的表達情況。
　　3.ALP及茜素紅染色測定MSCs及MSCs-CTLA4在免疫激活共培養(yǎng)前后對于POSTN成骨誘導效應的反應。
　　4.Western blotting實驗測定POSTN促進MSCs成骨分化的具體機制
　　結果：
　　1.X-ray及Micro-CT結果均顯示8周后DBM+MSCs-CTLA4組修復區(qū)新生骨塑形明顯優(yōu)于其余組，且橫斷面顯示MSCs-CT

14、LA4組修復區(qū)橈骨髓腔已完全再通，而其余兩組仍有不同程度的阻塞。相關骨生成數據分析結果顯示DBM+MSCs-CTLA4組中BMD，BV及BV/TV均高于其余兩組(P＜0.05)。免疫組化測定POSTN及β-catenin的表達強度在DBM+MSCs-CTLA4組中顯著高于其余兩組，IOD分析結果同觀察一致(P＜0.05)。
　　2.免疫細胞化學染色結果顯示MSCs及MSCs-CTLA4中的POSTN陽性染色均定位于胞質中。West

15、ern blotting及Q-PCR結果顯示在免疫激活共培養(yǎng)條件下，MSCs中POSTN的表達相對普通培養(yǎng)條件來說顯著降低(P＜0.05)，而MSCs-CTLA4組中POSTN的表達則保持在正常水平。
　　3.ALP及茜素紅染色結果顯示，POSTN的刺激可以顯著提高MSCs及MSCs-CTLA4中兩者的染色程度，而Integrinαvβ3封閉組可見該效應被抑制。同時在免疫激活共培養(yǎng)后，POSTN上調ALP及鈣結節(jié)生成的效應僅在MS

16、Cs-CTLA4組中可見，而在MSCs組中未觀察到此現象。IOD分析結果與觀察結果一致(P＜0.05)。
　　4.Western blotting結果顯示POSTN的刺激可上調MSCs組和MSCs-CTLA4組中低密度脂蛋白受體相關蛋白(lipoprotein-related p rotein，LRP)6的磷酸化水平，同時p-GSK-3β的水平也隨之增高，伴隨β-catenin和Runx2的表達上調，而Integrinαvβ3抑制

17、劑組則未見此效應發(fā)生。在免疫激活共培養(yǎng)后，該效應只在MSCs-CTLA4組中可見，而在MSCs組中未觀察到此現象。
　　全文結論：
　　1.MSCs-CTLA4構建的TEB在小鼠股骨旁異位移植模型中能夠有效成骨，且EphB4表達顯著高于其余組。體外免疫激活微環(huán)境可下調MSCs中EphB4的表達水平，而CTLA4的存在能夠維持MSCs中EphB4的表達。同時EphB4可通過與Wnt信號通路發(fā)生間接交聯反應來促進MSCs的成骨分

18、化。
　　2.EphB4的激活可以上調MSCs中POSTN的表達水平。
　　3.MSCs-CTLA4構建的TEB在兔橈骨缺損原位移植模型中成骨修復效果顯著，且移植區(qū)修復區(qū)POSTN的表達量顯著高于對照組。體外免疫激活微環(huán)境可下調MSCs中POSTN的表達水平，且能抑制POSTN對于MSCs的成骨誘導效應，而CTLA4的存在能夠逆轉該趨勢。
　　4.POSTN可與Wnt信號通路發(fā)生直接交聯反應，通過激活Wnt/LRP6/