水產(chǎn)品弧菌的等溫核酸擴(kuò)增可視化檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、弧菌屬是一類廣泛存在于海水、海產(chǎn)品中的細(xì)菌。其中有十幾種是能夠引起人疾病的病原菌，引起最多死亡率的是霍亂弧菌、副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌。海產(chǎn)品或其他食品中的弧菌是通過(guò)人攝入或者傷口感染至體內(nèi)引起嘔吐、腹瀉等一系列胃腸道疾病或敗血癥甚至死亡。生食海鮮的文化根深蒂固，卻成為弧菌等病原菌對(duì)人體健康不利的通道。隨著生食飲食文化的傳播，由弧菌引起的弧菌病報(bào)道也受到了關(guān)注?；【目焖贆z測(cè)和控制就成為了傳承飲食文化和維護(hù)人們安全健康的一個(gè)特別重要的途徑

2、。由于傳統(tǒng)的PCR方法的靈敏度、耗時(shí)等問(wèn)題，受到了自身的限制，所以有越來(lái)越多的研究關(guān)注于尋求更加適合即時(shí)檢測(cè)需求的方法。
　　金納米顆粒是符合量子點(diǎn)的具有良好光學(xué)性質(zhì)一種材料。能夠通過(guò)合成不同的尺寸和形狀，來(lái)獲得不同的光學(xué)性質(zhì)。在近幾年來(lái)，金納米顆粒已經(jīng)被引入生物感應(yīng)器中，解決了實(shí)際問(wèn)題，取得了很大的進(jìn)展。近十幾年來(lái)，等溫核酸擴(kuò)增的開發(fā)在各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。金納米顆粒在等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)中的作用發(fā)揮勢(shì)必會(huì)帶了更大的突破。本研究

3、以此為研究主旨，分析了環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，RPA)的反應(yīng)體系中各個(gè)組分與金納米顆粒之間的關(guān)系，摸索最佳反應(yīng)條件。建立了基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)對(duì)霍亂弧菌的檢測(cè)，并引入了金納米顆粒參與反應(yīng)。構(gòu)建了一套完整系統(tǒng)的方法，實(shí)現(xiàn)快速、低成本、靈敏可靠的可視化檢測(cè)。為基

4、礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室和檢測(cè)平臺(tái)提供高效的技術(shù)手段，為食源性致病菌的防控和食品安全監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下：
　　1、通過(guò)與qPCR方法對(duì)比，我們報(bào)道的RPA方法較為靈敏、快速和可靠，在不依賴昂貴設(shè)備儀器的條件下能夠定量檢測(cè)海產(chǎn)品中的霍亂弧菌。這種方法在10分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)的檢出限為5個(gè)拷貝，在八個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中具有很高的可重復(fù)性?；趌olB基因，RPA的特異性是霍亂弧菌物種內(nèi)高度保守的。RPA在食品行業(yè)中的可應(yīng)用性通過(guò)檢測(cè)45個(gè)對(duì)蝦

5、樣品來(lái)驗(yàn)證。總之，RPA方法是靈敏、快速的檢測(cè)方法，甚至可以量化海產(chǎn)品中的霍亂弧菌。
　　2、在霍亂弧菌 RPA擴(kuò)增反應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立了一個(gè)基于RPA與納米金材料的可視化檢測(cè)方法。首先，發(fā)現(xiàn)在RPA反應(yīng)體系中103個(gè)拷貝質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA在6 min后才擴(kuò)增出，而AuNPs-RPA反應(yīng)體系中同樣濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA較RPA在5.3 min已有擴(kuò)增信號(hào)，其他濃度下均出現(xiàn)AuNPs-RPA比RPA早起信號(hào)。說(shuō)明金納米材料可以提高 RP

6、A的反應(yīng)速率，使得加速了反應(yīng)啟動(dòng)。其次，闡述了 RPA中蛋白組分和引物與金納米顆粒之間的相互作用，為穩(wěn)定金納米材料提供一個(gè)理論基礎(chǔ)。在擴(kuò)增完成之后，觀察顏色變化，發(fā)現(xiàn)不同加樣順序和是否進(jìn)行引物孵育 AuNPs過(guò)程會(huì)影響顏色的結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果引物先與金納米顆粒孵育，然后加上酶，會(huì)使對(duì)金的保護(hù)力保持在最高水平，這時(shí)將不會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的顏色對(duì)比。在酶失活后再加金，因酶的構(gòu)象發(fā)生變化，此時(shí)再加金進(jìn)去，體系中大量鹽離子得以讓金團(tuán)聚；把溶

7、液調(diào)至酶的等電點(diǎn)附近，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都發(fā)現(xiàn)了沉淀現(xiàn)象；在加酶前讓引物和探針與金孵育過(guò)夜，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均始終保持紅色,結(jié)果顯示體系中的混合酶起到了保護(hù)金的作用而且是大分子的酶在空間上起到的保護(hù)和較強(qiáng)的吸附作用。為呈現(xiàn)定性可視化結(jié)果，需先加酶后加引物，最終有陽(yáng)性結(jié)果的顏色為藍(lán)色，陰性結(jié)果的顏色為紫紅色。原因是重組酶纏繞引物形成引物-酶聚合物，使得引物和酶都失去了金保護(hù)功能。雖然發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，雙鏈DNA無(wú)法彌補(bǔ)一些保護(hù)功能，對(duì)照組因沒(méi)有擴(kuò)增

8、使得重組酶和引物一直纏繞或始終處于纏繞釋放的動(dòng)態(tài)平衡?？傊?，金納米顆粒能夠提高RPA的反應(yīng)速率，并能定性地顯示結(jié)果，對(duì)RPA basic試劑盒的用戶而言，縮短了終點(diǎn)分析的時(shí)間，降低了實(shí)驗(yàn)成本。所以，本研究可以給使用 RPA基礎(chǔ)試劑盒的研究者提供簡(jiǎn)便的終點(diǎn)分析可視化方法。
　　3、基于 SH修飾引物的AuNPs-LAMP體系的研究?jī)?nèi)容包括：首先確定了ssDNA、dsDNA、dNTP、Bst DNA聚合酶對(duì)AuNPs的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

9、ssDNA、dsDNA、dNTP能使AuNPs分散系穩(wěn)定，而Bst DNA聚合酶對(duì)其有非特異性吸附，而使AuNPs之間因Bst DNA聚合酶而聚集在一起。
　　其次建立的方法中包括較為特別的方式加入金，以提高金的穩(wěn)定性和檢測(cè)的方便度。用AuNPs稀釋引物，形成紅色引物，同時(shí)讓SH修飾的引物與AuNPs自我組裝，摒棄了繁瑣的錨定步驟。摸索最佳反應(yīng)條件：溫度參數(shù)設(shè)置范圍為61-65℃；時(shí)間范圍在30-65 min內(nèi)；選用16 nm直徑

10、AuNPs濃度2.3 nM、11.5 nM、23 nM、46nM。獲得最佳反應(yīng)條件，即63℃55 min，采用AuNPs23 nM。
　　最終將該可視化方法應(yīng)用于檢測(cè)副溶血性弧菌，確定了它的最低檢測(cè)限，在55 min內(nèi)達(dá)到了定性和200 pg以上可半定量的結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果和陰性結(jié)果可以根據(jù)管內(nèi)產(chǎn)物顏色是否為紅色或者藍(lán)色鑒別。
　　4、基于PEG空間位阻劑的未修飾AuNPs參與LAMP比色法檢測(cè)，提出了采用 PEG減少金納米顆粒

11、之間的碰撞幾率，增加空間穩(wěn)定性的機(jī)理，并用實(shí)驗(yàn)結(jié)果一一進(jìn)行驗(yàn)證。摸索PEG濃度從9％至39%，最終發(fā)現(xiàn)最佳濃度為39%。
　　基于兩種原理，PEG-AuNPs和SH引物-AuNPs LAMP兩種方法進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)顏色變化正好相反，陽(yáng)性結(jié)果呈藍(lán)色，陰性結(jié)果呈紅色。以副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌為研究對(duì)象，加入兩者各自的靶向引物，實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)， PEG-AuNPs方法也能在63℃條件下55 min內(nèi)100fg以上的半定量檢測(cè)，比SH引物-A

12、uNPs較為靈敏。因此，PEG-AuNPs方法可成為半定量可視化檢測(cè)手段，雖以弧菌的特異性檢測(cè)為目的，但可普及到其他病原體或其他目標(biāo)物的核酸檢測(cè)，為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室和檢測(cè)平臺(tái)提供高效的技術(shù)手段，為食源性致病菌的防控和食品安全監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支撐。
　　整體來(lái)看，金納米顆粒材料參與的等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系能夠很好地適應(yīng)即時(shí)檢測(cè)的需求，不受大型儀器的束縛，在可視化檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。在可視化的同時(shí)，還能避免交叉污染、提高反應(yīng)速率或進(jìn)行多重