核糖體蛋白S6在U3核蛋白復(fù)合體中的定位及功能.pdf

1、核糖體蛋白S6(rpS6),在高等真核細胞中由249個氨基酸組成,是核糖體40S小亞基的組成成分,位于小亞基的頭部,在mRNA翻譯時,直接與mRNA、tRNA以及蛋白翻譯起始因子結(jié)合,從而影響蛋白質(zhì)的合成、細胞大小等。此外,作為早期核糖體蛋白之一,它還可以進入細胞核中,定位于核仁,參與核糖體亞單位的組裝。在本研究中,使用帶有EGFP標(biāo)簽(C端)的rpS6基因重組質(zhì)粒(rpS6-1)轉(zhuǎn)染的高等真核細胞HEK293以及野生型HEK293細胞

2、進行的免疫熒光實驗表明:rpS6蛋白不僅分布在細胞質(zhì)中,而且還分布在核仁中。這與以前的研究報道相符。重要的是在研究過程中發(fā)現(xiàn)rpS6蛋白定位于核仁這一特征在整個細胞群體中存在異質(zhì)性,即在細胞群體中僅有部分細胞的核仁中可檢測到rpS6蛋白存在,另一部分細胞的細胞核仁中檢測不到rpS6蛋白存在,推測rpS6蛋白進入核仁可能與細胞周期有關(guān)。使用rpS6-1轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細胞系進行了24h活細胞工作站觀察和細胞周期阻滯實驗。在使用活細胞工作站觀察時

3、,發(fā)現(xiàn)細胞在分裂前期(G2期)的細胞核中有較強熒光的rpS6-EGFP存在,當(dāng)細胞進入分裂期(M期)時,rpS6-EGFP隨著核仁的消失而消失,分裂產(chǎn)生的兩個子細胞的細胞核中,觀察不到rpS6-EGFP的存在(G1期),隨著子細胞的生長,開始在細胞核中觀察到rpS6-EGFP出現(xiàn),并且綠色熒光強度隨著時間的延長逐漸增加(G1期后期或S期)。細胞周期阻滯實驗表明:當(dāng)在培養(yǎng)基中加入過量的胸苷將細胞周期阻滯在S期時,流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)S期細胞

4、比例高達99.48％,而rpS6蛋白入核細胞比例僅為85%,S期細胞比例大于rpS6蛋白入核細胞比例,說明在所有的S期細胞群體中,有一部分細胞的細胞核中沒有rpS6-EGFP蛋白,而另一部分細胞的細胞核中有rpS6-EGFP蛋白存在,提示rpS6蛋白是在S期的中期或者后期進入細胞核的,并且數(shù)量隨著細胞生長逐漸增加,直至M期離開。使用秋水仙素將細胞周期阻滯在M期以及使用正常培養(yǎng)的細胞進行的檢測結(jié)果同樣也支持上述結(jié)論。
　　為了對rp

5、S6蛋白在核仁中的分布進行進一步的精確定位,對rpS6-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK23細胞(使用針對EGFP蛋白和Mpp10蛋白的抗體)以及野生型HEK293細胞(使用針對rpS6蛋白和Mpp10蛋白的抗體)進行了免疫熒光雙標(biāo)實驗。Mpp10蛋白是U3核蛋白復(fù)合體(U3RNP)的標(biāo)志性蛋白,U3RNP是真核細胞核仁中的第三大核蛋白復(fù)合體,負責(zé)18SrRNA的加工成熟。結(jié)果表明:不論是rpS6-EGFP還是野生型rpS6蛋白均可與Mpp10蛋白共

6、定位。Bernstein等的研究結(jié)果表明:在酵母細胞中,rpS6蛋白與Mpp10蛋白存在相互作用。在本研究中使用野生型HEK293細胞進行的鄰位連接實驗以及使用rpS6-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細胞進行的免疫共沉淀實驗結(jié)果表明:在野生型HEK293細胞中rpS6蛋白與Mpp10蛋白共定位并且存在相互作用,在rpS6-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細胞中rpS6-EGFP蛋白與Mpp10蛋白共沉淀,上述結(jié)果提示:在高等真核細胞中,rpS6蛋白可

7、能是U3RNP的一個組成成分。
　　在高等真核細胞中,能夠進入細胞核的大分子蛋白質(zhì)一般都具有核定位信號(n-uclearlocalizationsequence,NLS)。在本研究中,構(gòu)建了一系列的rpS6蛋白突變體,分別為rpS6-2(1～249,Δ167～170),rpS6-3(1～249,Δ188～191),rpS6-4(1～249,Δ230～233),rpS6-5(1～249,Δ167～170,188～191,230～23

8、3),rpS6-6(SV40,1～172),rpS6-7(SV40,1～172,Δ72～98),rpS6-8(99～249),rpS6-9(99～249,Δ173～203),rpS6-10(1～249,Δ72～98,173～203),rpS6-11(1～249,S78A),rpS6-12(1～249,S148A),rpS6-13(1～249,S78A,S148A)。將這些突變體克隆入pcDNA3.1-EGFP真核表達載體中,然后將其轉(zhuǎn)染

9、入高等真核細胞HEK293。CLSM觀察發(fā)現(xiàn):rpS6-2、rpS6-4、rpS6-11、rpS6-12以及rpS6-13分布在每個細胞的細胞質(zhì)中,核基質(zhì)中沒有分布,在部分細胞的核仁中可檢測到這些突變體的存在,并且熒光強度從強到弱,存在異質(zhì)性,與rpS6-EGFP蛋白分布情況一致;而rpS6-3、rpS6-5、rpS6-6、rpS6-7、rpS6-8、rpS6-9以及rpS6-10突變體則主要分布在整個細胞核中,細胞質(zhì)中觀察不到。上述結(jié)

10、果首先表明:167KKPR170、188KRRR191、230KRRR233、1MKLNISFPATGCQKLIEVDDERKLRTFYEKRMATEVAADALGEEWKGYVVRISGGNDKQGFPMKQGVLTHGRVRLLLSKGHSCYRPRRTGERKRKSVR98以及173APKIQRLVTPRVLQHKRRRIALKKQRTK203均不是或不含rpS6蛋白的入核信號,因為rpS6-2(1～249,Δ167～170),r

11、pS6-3(1～249,Δ188～191),rpS6-4(1～249,Δ230～233),rpS6-8(99～249),rpS6-9(99～249,Δ173～203),rpS6-10(1～249,Δ72～98,173～203)都可以進入細胞核內(nèi),推測rpS6蛋白的入核信號很可能存在于99GCIVDANLSVLNLVIVKKGEKDIPGLTDTTVPRRLGPKRASRIRKLFNLSKEDDVRQYVVRKPLNKEGKKPRTK17

12、2和204EEAAEYAKLLAKRMKEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSESSQK249段的氨基酸序列內(nèi),因為rpS6-9(99～249,Δ173～203)可以進入細胞核內(nèi)。分析這兩段氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)在204～249段的氨基酸序列內(nèi)存在兩個典型的包含有4～8個堿性氨基酸的核定位信號215KR[MKEAKEKRQEQIA]KRRR233以及223KR[QEQIA]KRRR233。其次,證明了Ser78和Ser148兩個

13、潛在的磷酸化位點的磷酸化也不能影響rpS6蛋白的入核,因為rpS6-11(1～249,S78A),rpS6-12(1～249,S148A),rpS6-13(1～249,S78A,S148A)都可以進入細胞核內(nèi),最后,證明了188KRRR191和72RVRLLLSKGHSCYRPRRTGERKRKSVR98序列與rpS6蛋白在胞質(zhì)中的定位有關(guān),因為rpS6-3(1～249,Δ188～191),rpS6-5(1～249,Δ167～170,1

14、88～191,230～233),rpS6-6(SV40,1～172),rpS6-7(SV40,1～172,Δ72～98),rpS6-8(99～249),rpS6-9(99～249,Δ173～203)以及rpS6-10(1～249,Δ72～98,173～203)突變體在細胞質(zhì)中均檢測不到。
　　為了排除EGFP蛋白(238aa)的空間位阻或成熟過程對rpS6蛋白分布造成的影響,我們又構(gòu)建了rpS6蛋白與HA蛋白(9aa)的融合蛋白(

15、rpS6-14),轉(zhuǎn)染HEK293細胞獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系,使用針對HA標(biāo)簽的抗體進行免疫熒光實驗檢測rpS6蛋白在細胞內(nèi)的分布,結(jié)果表明HA-rpS6蛋白與rpS6-EGFP蛋白在細胞內(nèi)的分布情況一致,表明EGFP蛋白未對rpS6蛋白在細胞內(nèi)的分布造成影響。
　　LiH和MayerC等在研究過程中發(fā)現(xiàn)雷帕霉素在酵母細胞中可以通過影響TOR分子與rDNA的啟動子區(qū)結(jié)合或者降低RNApolymeraseI分子活性而降低酵母細胞中總r

16、RNA的合成。高等真核細胞中,rpS6蛋白C端有5個高度保守的絲氨酸磷酸化位點,分別為Ser235、Ser236、Ser240、Ser244和Ser247,它們組成了rpS6蛋白目前研究的比較透徹的功能域。Ser235、Ser236、Ser240以及Ser244的磷酸化需要p70S6K1和p90S6K2兩種蛋白激酶的聯(lián)合作用,而Ser247的磷酸化則需要酪蛋白激酶1的催化。在本研究中設(shè)計了rpS6蛋白的兩個突變體rpS6A和rpS6D。

17、rpS6A是將rpS6蛋白C端的5個絲氨酸磷酸化位點全部突變?yōu)楸彼?該突變體可模擬去磷酸化rpS6蛋白的功能;rpS6D突變體是將rpS6蛋白C端的5個絲氨酸磷酸化位點全部突變?yōu)樘於彼?該突變體可模擬磷酸化rpS6蛋白的功能。當(dāng)使用一種尿嘧啶核苷類似物5-ethynyluridine(EU)標(biāo)記野生型HEK293細胞以及rpS6A、rpS6D穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞,在加入雷帕霉素后新合成的RNA,然后使用Image-ProPlus軟件分析新合

18、成的RNA的量。結(jié)果表明:不論是野生型HEK293細胞,還是rpS6A和rpS6D穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞,在加入雷帕霉素后,細胞內(nèi)新合成的總RNA量與未加雷帕霉素?zé)o明顯差異(P>0.05),說明雷帕霉素并不能影響高等真核細胞中總RNA的轉(zhuǎn)錄。RobledoS等的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用siRNA干涉的方法敲除Hela細胞中rpS6蛋白表達后,最明顯的特征是41S前體rRNA減少,30S前體rRNA堆積,21S前體rRNA和成熟18SrRNA減少,而成熟

19、的28SrRNA和5.8SrRNA的含量未受影響。在條件性敲除了rpS6基因的小鼠肝臟細胞中,也觀察到了34Spre-rRNA的堆積,新合成的18SrRNA則檢測不到,說明rpS6蛋白對于30Spre-rRNA加工成為成熟的18SrRNA是必須的。依據(jù)HadjiolovaKV等對Hela細胞中rRNA加工成熟途徑的研究結(jié)果判斷,rpS6蛋白可能與pre-rRNA的A1剪切位點(3657nt)的剪切有關(guān)。上述LiH等在研究過程中發(fā)現(xiàn):當(dāng)在

20、酵母細胞的培養(yǎng)基中加入雷帕霉素后,除可觀察到25SrRNA和18SrRNA含量明顯減少外,同時還觀察到35Spe-rRNA和27Spe-rRNA(相當(dāng)于高等真核細胞30Spre-rRNA)含量增加。雷帕霉素作為mTOR的特異性抑制劑,可以通過mTOR-S6K-S6信號通路,間接的影響rpS6蛋白C端的4個絲氨酸磷酸化(Ser235、Ser236、Ser240、Ser244)。當(dāng)使用雷帕霉素抑制了rpS6A和rpS6D穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞以及野生

21、型HEK293細胞內(nèi)源性的rpS6蛋白C端的這4個絲氨酸磷酸化后,由這5個絲氨酸磷酸化位點組成的功能域不能發(fā)揮作用。采用Northernblot的方法,使用針對前體rRNA的探針(該探針可檢測47Spre-rRNA、45Spre-rRNA、30Spre-rRNA、21Spre-rRNA以及18S-Epre-rRNA),可在野生型HEK293細胞以及rpS6A穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞中檢測到30Spre-rRNA堆積,而rpS6D穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中未檢