南瓜韌皮液mRNA結(jié)合蛋白的純化與CmRBP50核糖核蛋白復(fù)合體形成的分子機(jī)制.pdf

1、植物韌皮部作為植物維管束重要的組成部分，不僅充當(dāng)著同化碳水化合物的運(yùn)輸通道，更因其內(nèi)含激素、活性氧、鈣離子、RNA與蛋白等信息物質(zhì)而充當(dāng)著協(xié)調(diào)植物系統(tǒng)生長與發(fā)育的信息高速公路。植物維管系統(tǒng)對于植物響應(yīng)環(huán)境逆境變化也起著舉足輕重的作用，深入了解植物韌皮部長距離信號物質(zhì)及其作用可提供提高農(nóng)作物生產(chǎn)率的手段。南瓜因其維管柬分明，容易采集韌皮液而成為研究維管束系統(tǒng)最好的模式植物之一。目前其韌皮液內(nèi)RNA轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組已獲得，但是我們對其韌皮液

2、內(nèi)上千RNA與蛋白的研究還只是冰山一角，仍有很多問題尚待研究。本實(shí)驗(yàn)室此前研究發(fā)現(xiàn)了RNA結(jié)合蛋白CmRBP50在南瓜韌皮液內(nèi)形成了一個核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)復(fù)合體，這是目前為止在植物中獲得的第一個能進(jìn)行長距離運(yùn)輸?shù)暮颂呛说鞍讖?fù)合體，但是關(guān)于此復(fù)合體的形成機(jī)制還不清楚。本文以南瓜(Cucurbita maxima cv Big Max)為材料，通過生物化學(xué)、分子生物學(xué)等手段研究了南瓜韌皮液內(nèi)可能的mRN

3、A結(jié)合蛋白及基于CmRBP50核糖核蛋白復(fù)合體的形成分子機(jī)理。取得主要結(jié)果如下：
　　 1.運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)手段研究了南瓜韌皮液內(nèi)可能的mRNA結(jié)合蛋白。通過Poly(U)親和柱結(jié)合液相串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)獲得了南瓜韌皮液內(nèi)29個潛在的mRNA結(jié)合蛋白。其功能包括與RNA代謝、翻譯相關(guān)，與蛋白代謝、運(yùn)輸相關(guān)，與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能量產(chǎn)生相關(guān)，與代謝相關(guān)及一些功能未知的蛋白。
　　 2.研究了CmRBP50的磷酸化位點(diǎn)及

4、其對于CmRBP50RNP形成的重要性。首先通過蛋白o(hù)verlay技術(shù)明確了磷酸化修飾對基于CmRBP50RNP形成的重要性，然后通過液相串聯(lián)質(zhì)譜鑒定獲得了四個磷酸化位點(diǎn)絲氨酸223、438、440和444。通過點(diǎn)突變及小西葫蘆黃化花葉病毒(Zucchiniyellow mosaic virus，ZYMV)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化獲得了CmRBP50及S223A(絲氨酸223突變?yōu)楸彼?，STripleA(絲氨酸438、440、444分別突

5、變?yōu)楸彼?，SQuadA(絲氨酸223、438、440、444分別突變?yōu)楸彼?等點(diǎn)突變蛋白。蛋白o(hù)verlay與免疫共沉淀技術(shù)證實(shí)了以上磷酸化位點(diǎn)對于此RNP形成的重要性，尤其是C端Ser438、440和444突變?yōu)楸彼岷罂沙浞謩冸xCmRBP50與其他蛋白間的互作。最后，我們克隆并表達(dá)了CmRBP50的潛在互作蛋白，運(yùn)用體外pull down技術(shù)證實(shí)CmRBP50與CmPP16，GTPbP及PSPL可發(fā)生體外互作，且其C端的磷酸化

6、修飾對其互作至關(guān)重要。
　　 3.研究了可能磷酸化CmRBP50的激酶。通過運(yùn)用膠內(nèi)磷酸化(In gel kinaseassay)技術(shù)從維管束蛋白與韌皮液蛋白著手，鑒定了可能磷酸化CmRBP50的激酶。通過對可疑位點(diǎn)質(zhì)譜鑒定我們得到核苷二磷酸激酶，絲/蘇氨酸激酶，蛋白激酶adk1和蛋白激酶Csa000515及糖原合成酶激酶-3等可能的激酶，經(jīng)論證推測最有可能的是糖原合成激酶-3。
　　 本文通過對韌皮液內(nèi)mRNA結(jié)合蛋白