Gankyrin對胃癌細胞生物學(xué)行為和化療敏感性的影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　Gankyrin是一個新的癌基因，最早在肝癌組織發(fā)現(xiàn)。Gankyrin編碼的蛋白含有226個氨基酸，由7個錨蛋白(ankyrin)重復(fù)序列組成，在結(jié)構(gòu)上高度保守，分子量約為25kDa。研究表明，肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤組織中g(shù)ankyrin蛋白高表達，并且與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，顯示gankyrin在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。
　　盡管gankyrin在不少惡性腫瘤中高表達，然而現(xiàn)有的研究大部分集中

2、在gankyrin與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及耐藥等方面，在胃癌等其它腫瘤的研究還不夠深入，沒有形成體系，缺少gankyrin與胃癌、頭頸部腫瘤、肺癌、大腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤關(guān)系的研究。所以，本實驗擬深入探討gankyrin對胃癌細胞生物學(xué)行為和化療敏感性的影響及作用機制，對胃癌的預(yù)防、診斷、預(yù)后判斷及尋找新的藥物靶點都具有重要意義。
　　方法:
　　1、采用Western blot法和免疫組織化學(xué)檢測胃癌和癌旁正常組織中g(shù)an

3、kyrin的表達，同時評價gankyrin與臨床特征的關(guān)系。
　　2、RT-PCR和Western blot檢測4種胃癌細胞系（SGC-7901、MGC-803、BGC-823、HGC-27）中g(shù)ankyrin的蛋白及mRN表達水平。
　　3、使用脂質(zhì)體法將gankyrin的真核表達載體轉(zhuǎn)染入BGC-823細胞，將gankyrin特異siRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入胃癌HGC-27細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆。
　

4、　4、通過流式細胞術(shù)、MTT實驗、軟瓊脂集落形成實驗等方法觀察gankyrin在胃癌細胞系增殖中的作用。
　　5、裸鼠皮下成瘤實驗評估gankyrin表達改變后，對胃癌細胞的體內(nèi)成瘤能力及移植瘤生長的影響。
　　6、Western blot及RT-PCR檢測gankyrin上調(diào)、下調(diào)表達后胃癌細胞中細胞周期相關(guān)分子(cyclinD1、cyclinE、PCNA、Rb、p53和p27)mRNA及蛋白表達的變化;Western b

5、lot檢測上述轉(zhuǎn)染細胞中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達情況(PI3K、AKT、磷酸化PI3K和磷酸化AKT)。
　　7、MTT法檢測gankyrin與胃癌細胞化療藥物敏感性的關(guān)系，Hoechst及AV/PI法檢測細胞凋亡，Western blot檢測凋亡蛋白caspase3和capase9的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、Gankyrin在胃癌細胞系和胃癌組織中存在不同程度的表達。Gankyrin在胃癌組織的陽性表達

6、率100.00％(78/78)，明顯高于癌旁正常組織[癌旁正常組織的陽性表達率為62.82％(49/78)，P＜0.01]。各胃癌細胞系(SGC-7901、MGC-803、BGC-823和HGC-27)均有表達gankyrin，其中HGC-27表達水平最高，BGC-823最低。
　　2、Gankyrin對胃癌細胞體內(nèi)外生長增殖能力的影響。轉(zhuǎn)染gankyrin正義表達載體的胃癌BGC-823細胞較親本細胞生長速度顯著加快，進入S期的

7、細胞比例增加，胃癌細胞裸鼠皮下成瘤能力及集落形成能力明顯增強;而通過siRNA特異下調(diào)gankyrin表達的HGC-27胃癌細胞的生長能力比親本細胞明顯減弱，處于S期的細胞顯著減少，細胞集落形成能力顯著下降，裸鼠皮下移植瘤的生長也明顯受到抑制。
　　3、Gankyrin調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)分子及對PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的影響。過表達gankyrin的BGC-823細胞中，細胞周期相關(guān)分子cyclinE、cyclin D1和PCN

8、A表達上調(diào)，而p27、p53和Rb表達下降。當通過siRNA下調(diào)HGC-27細胞gankyrin表達后，cyclin E、cyclin D1和PCNA表達明顯下降，而p27、p53和Rb則表達升高。siRNA下調(diào)gankyrin的表達之后，PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表達減少;而過表達gankyrin后，PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表達增加。

9、r>　　4、Gankyrin與化療藥物敏感性的關(guān)系。siRNA下調(diào)HGC-27細胞gankyrin的表達與順鉑、5-Fu作用，細胞的IC50減少，凋亡細胞數(shù)增多，凋亡蛋白caspase3和caspase9表達增加;而轉(zhuǎn)染gankyrin正義載體的胃癌BGC-823細胞與順鉑、5-Fu作用，細胞的IC50升高，凋亡細胞數(shù)減少，凋亡蛋白caspase3和caspase9表達下降。
　　結(jié)論:
　　1、胃癌組織gankyrin的表

10、達明顯高于癌旁正常組織，四種胃癌細胞系（SGC-7901、MGC-803、BGC-823和HGC-27）不同程度的表達gankyrin。
　　2、Gankyrin與胃癌細胞體內(nèi)、外的生長增殖相關(guān)。
　　3、Gankyrin能通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)分子來加速細胞周期G1/S進展，從而影響胃癌細胞的生長增殖能力。Gankyrin可能通過激活PI3K/AKT通路影響胃癌細胞的生長和增殖。
　　4、Gankyrin可能通過促進細