PEBP4表達(dá)對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為及化療藥物敏感性影響的初步研究.pdf

1、作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)所有原位腫瘤中最常見的腫瘤，膠質(zhì)瘤大概占顱內(nèi)惡性腫瘤的50％左右。美國每年有超過14000位新患者被診斷出腦膠質(zhì)瘤，其每年的全國發(fā)病率為0.005％。其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者占總數(shù)的60-70％，間變性星形細(xì)胞瘤占10-15％，間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和間變性少突星形細(xì)胞瘤大約占10％，其余為罕見的腫瘤如間變性室管膜瘤和間變性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤。因?yàn)榇蟛糠帜z質(zhì)瘤為浸潤性、彌漫性生長，與周邊正常腦組織邊界不清而且容易復(fù)發(fā)，故患者治愈

2、率低、預(yù)后欠佳、總體生存期較短。盡管采取了最佳的治療方案包括手術(shù)切除輔以放療和（或）化療等綜合性治療，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存期僅僅為12-15個月，間變性膠質(zhì)瘤患者則為2-5年。在膠質(zhì)瘤臨床化學(xué)藥物治療中，相當(dāng)數(shù)量的膠質(zhì)瘤對化療產(chǎn)生耐藥性是后期治療效果欠佳的主要原因，現(xiàn)在一線臨床化療藥物的實(shí)際有效率僅僅維持在20-30％左右。所以，有效解決化療藥物的耐藥性成為提高膠質(zhì)瘤患者預(yù)后生存率的重要途徑。因此，研究膠質(zhì)瘤中調(diào)節(jié)細(xì)胞耐藥行為的相

3、關(guān)基因有助于我們進(jìn)一步了解耐藥的分子機(jī)制，同時可以指導(dǎo)臨床制定膠質(zhì)瘤患者的個性化化療方案并判斷預(yù)后，這還為將來膠質(zhì)瘤的分子生物學(xué)治療提供相對理想的靶標(biāo)基因。
　　作為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族的新成員，PEBP4在人體各組織中都有一定的表達(dá)，它參與質(zhì)膜生物合成、神經(jīng)元發(fā)育、精子的形成、細(xì)胞凋亡等生理及病理生理過程，是一類體內(nèi)普遍存在的多功能復(fù)合型蛋白。近期相關(guān)研究表明PEBP4在腫瘤細(xì)胞中多方面的起著抗凋亡的生理病理作用，使其在腫瘤

4、的發(fā)生發(fā)展過程中具有癌基因的功能同時發(fā)揮促癌作用。在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的PEBP4可以抑制TNF-α（腫瘤壞死因子-α）或者TRAIL（腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，包括抑制凋亡相關(guān)蛋白p53，p21CIP/WAF和BAX（Bcl2-相關(guān)X蛋白）的表達(dá)，同時提高凋亡抑制蛋白Bcl2和Bcl-XL的表達(dá)。另外，PEBP4不僅參與MAPK信號通路的抑制，而且抑制JNK信號通路同時激活A(yù)KT通路，從而影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡

5、。由此可見PEBP4是腫瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié)多條信號通路的關(guān)鍵因子，而這些上游的信號通路恰好能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、分裂及凋亡，所以更深入地研究PEBP4將有助于進(jìn)一步了解腫瘤細(xì)胞的復(fù)雜生物學(xué)機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)擬在探討PEBP4在腦膠質(zhì)瘤中的具體生物學(xué)功能，我們首先明確PEBP4在不同級別的膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的基因和蛋白表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與相關(guān)臨床資料特別是患者預(yù)后的相關(guān)性。其次，利用小片段RNA干擾和慢病毒載體干擾技術(shù)，構(gòu)建PE

6、BP4不同表達(dá)水平的細(xì)胞株，同時觀察其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株增殖、侵襲及細(xì)胞周期等惡性生物學(xué)的影響。隨后，檢測PEBP4干擾后膠質(zhì)瘤細(xì)胞株增殖、侵襲、細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，明確PEBP4分子與ERK1/2信號通路可能存在的相互關(guān)系。最后，我們將PEBP4干擾后的細(xì)胞株與替莫唑胺進(jìn)行共同培養(yǎng)，觀察PEBP4表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療敏感性的影響。本次實(shí)驗(yàn)共分三部分:第一部分，PEBP4在不同級別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平以及其與患者預(yù)后的相關(guān)

7、性;第二部分，通過PEBP4慢病毒干擾載體感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，觀察PEBP4表達(dá)變化對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株增殖、侵襲和細(xì)胞周期的影響，同時利用shRNA干擾細(xì)胞PEBP4的表達(dá)，研究ERK1/2通路對膠質(zhì)瘤增殖、侵襲及凋亡的影響;第三部分，觀察不同表達(dá)水平的PEBP4對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株替莫唑胺敏感性的影響及可能的機(jī)制，探討shRNA-PEBP4聯(lián)合替莫唑胺作用對細(xì)胞株克隆能力影響。
　　第一部分 PEBP4在膠質(zhì)瘤臨床組織標(biāo)本中的表達(dá)研究

8、>　　目的:研究PEBP4在不同級別膠質(zhì)瘤臨床組織標(biāo)本中的mRNA和蛋白表達(dá)水平，探討PEBP4表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系以及對患者預(yù)后的影響。
　　方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)及Western blot檢測PEBP4在58例不同級別膠質(zhì)瘤組織的蛋白表達(dá)水平，同時運(yùn)用Real-time PCR檢測PEBP4的mRNA表達(dá)水平。通過統(tǒng)計學(xué)方法驗(yàn)證其與臨床病理因素之間的關(guān)系以及對膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響。
　　結(jié)果:腫瘤組織中PEBP4的m

9、RNA表達(dá)可能與膠質(zhì)瘤級別呈正相關(guān)(p＜0.05)，同時PEBP4的蛋白表達(dá)相對于正常腦組織有明顯增高，這與mRNA的表達(dá)情況是一致的，而且PEBP4的蛋白表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤級別的變高而顯著增強(qiáng)(p＜0.05)。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)PEBP4主要在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中表達(dá)，在胞漿中呈彌漫性分布，棕色或棕黃色顆粒主要集中在細(xì)胞膜。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PEBP4表達(dá)與患者年齡、性別、KPS評分均無統(tǒng)計學(xué)意義，但是與膠質(zhì)瘤WHO分級關(guān)系密切(p=0.023)。

10、單因素和多因素Cox回歸顯示，膠質(zhì)瘤患者的生存時間與WHO分級(p=0.013)和PEBP4表達(dá)(p=0.006)明顯相關(guān)。進(jìn)一步的多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，在所有的臨床病理因素和生化參數(shù)中，PEBP4表達(dá)是判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后的唯一獨(dú)立因素。并且PEBP4的高表達(dá)提示膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后。
　　結(jié)論:隨著膠質(zhì)瘤病理級別的增高，PEBP4的基因和蛋白表達(dá)同時隨之上調(diào)。同時相對于其它臨床因素，它是影響患者預(yù)后的獨(dú)立干預(yù)因素，并且PEBP4

11、的高表達(dá)提示膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后。
　　第二部分 PEBP4在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的功能及分子機(jī)制研究
　　目的:利用慢病毒載體抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U373中PEBP4的表達(dá)，探討PEBP4變化對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251和U373增殖、侵襲和凋亡的影響。同時觀察shRNA干擾PEBP4表達(dá)后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中U251和U373細(xì)胞周期、增殖、侵襲及凋亡的相關(guān)重要因子表達(dá)。并且進(jìn)一步研究細(xì)胞株U251中PEBP4表達(dá)下調(diào)后，ERK1/2

12、信號通路相關(guān)蛋白的變化。
　　方法:運(yùn)用PEBP4慢病毒干擾載體感染U251、U373細(xì)胞株，構(gòu)建PEBP4低表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。MTT法測定細(xì)胞增殖能力，Transwell試驗(yàn)檢測侵襲水平，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期改變。Western blot測定腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡相關(guān)蛋白p-Rb、Cyclin D1、E-cadherin、Bcl-2及caspase-3的變化，同時測定ERK1/2信號通路的變化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中使用ERK1/2

13、信號通路的特異性抑制劑U0126處理感染后的細(xì)胞株U251，利用Western blot檢測ERK1/2以及相關(guān)蛋白的變化，再次運(yùn)用MTT檢測各組腫瘤細(xì)胞的增殖改變。
　　結(jié)果:shRNA-PEBP4干擾載體構(gòu)建結(jié)果滿意，慢病毒包裝成功，感染U251和U373細(xì)胞后可顯著下調(diào)PEBP4的表達(dá)。MTT檢測結(jié)果說明，干擾PEBP4表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U373的增殖能力明顯減弱(p＜0.05);侵襲性試驗(yàn)表明PEBP4表達(dá)下調(diào)后腫

14、瘤細(xì)胞的侵襲能力則顯著降低(p＜0.01);細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)PEBP4干擾病毒載體轉(zhuǎn)染U251和U373后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯，S期和G2/M期縮短(p＜0.05)。進(jìn)一步Western blot結(jié)果證實(shí)，PEBP4干擾后的U251和U373細(xì)胞中，p-Rb和細(xì)胞周期相關(guān)因子Cyclin D1表達(dá)下調(diào)，而侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin上調(diào)，促凋亡因子caspase-3表達(dá)增加，抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)則減少，同時ERK1/

15、2磷酸化水平升高，而總ERK1/2則沒有影響。使用特異性抑制劑U0126干擾ERK1/2通路后，Westernblot結(jié)果顯示caspase-3表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)則降低，表達(dá)趨勢與PEBP4干擾后的檢測結(jié)果相似，然而PEBP4的蛋白表達(dá)則無明顯變化。最后在shRNA-PEBP4處理后的U251細(xì)胞株中加入ERK1/2抑制劑U0126，結(jié)果顯示shR-PEBP4+NC組相對shR-ctrl+ U0126組，腫瘤細(xì)胞的增殖能力明顯下降

16、，這提示了ERK1/2可能是PEBP4的下游效應(yīng)分子。
　　結(jié)論:PEBP4可能是通過調(diào)控ERK1/2信號通路，間接影響腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)程，從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡能力的改變。
　　第三部分 PEBP4表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺敏感性的影響
　　目的:探討PEBP4干擾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251MG和U373MG對化療藥物替莫唑胺(TMZ)敏感性的影響。
　　方法:使用PEBP4慢病毒干擾載體感染U251、

17、U373細(xì)胞株，建立PEBP4不同表達(dá)水平的U251、U373細(xì)胞系。此細(xì)胞系與不同濃度替莫唑胺共培養(yǎng)三天，MTT法測定第三天的細(xì)胞抑制率并計算各個IC50值。軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗(yàn)檢測替莫唑胺對U251、U251-shRNA、U251-GFP及U373、U373-shRNA、U373-GFP克隆形成能力的影響。通過Western blot檢測U251、U373細(xì)胞中PEBP4干擾后多藥耐藥蛋白(P-gp，MRP1)及DNA損傷修復(fù)酶(

18、MGMT, MMR)的變化。
　　結(jié)果:利用3天MTT法測腫瘤細(xì)胞生長抑制率并計算IC50，結(jié)果在U251和U373細(xì)胞株中單獨(dú)使用TMZ的耐藥指數(shù)分別為23.26±2.44ug/mL和21.65±2.01 ug/mL，同時U251和U373的空載體組與TMZ聯(lián)合作用的耐藥指數(shù)分別為21.33±1.27ug/mL和22.78±1.88ug/mL，然而干擾PEBP4表達(dá)組與TMZ聯(lián)合后U251和U373細(xì)胞對TMZ的耐藥指數(shù)分別為9

19、.78±1.03ug/mL和8.06±1.82ugmL，相當(dāng)于前二組指數(shù)明顯下降(p＜0.05)。在替莫唑胺濃度分別為0、0.05、0.10、0.15μ mol/L時培養(yǎng)72h，U251-shRNA細(xì)胞組的克隆存活率分別為0.745±0.09、0.34±0.08、0.09±0.01、0.015±0.001，U373-shRNA細(xì)胞組的克隆存活率分別為0.713±0.16、0.29±0.07、0.06±0.01、0.01±0.001，結(jié)果

20、表明，在TMZ濃度相同的情況下，二組細(xì)胞系中PEBP4干擾組的克隆存活率均顯著低于對照組及空白組(p＜0.05)。抑制PEBP4表達(dá)后，U251及U373細(xì)胞株中P-gp和MRP1的蛋白表達(dá)均無變化，而MGMT和MMR的蛋白表達(dá)均顯著下降。
　　結(jié)論:PEBP4表達(dá)下調(diào)后可以增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺的藥物敏感性，shRNA-PEBP4聯(lián)合替莫唑胺可以明顯降低腫瘤細(xì)胞的克隆能力，這可能是因?yàn)橥ㄟ^影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)酶及凋亡的