藥物及膜電位對(duì)M-Kv7鉀通道、TRPV1通道及細(xì)胞膜PIP2的調(diào)控作用及其生理學(xué)意義.pdf

1、TRPV1是一種非選擇性陽(yáng)離子通道，高表達(dá)于傷害性感覺(jué)神經(jīng)元。TRPV1可以被辣椒素、氫離子(pH<5.8)、高溫(>43℃)，以及一些內(nèi)源性配體如炎癥發(fā)生時(shí)的脂氧化酶產(chǎn)物和大麻素(anandamide)等激活。TRPV1被認(rèn)為是介導(dǎo)疼痛發(fā)生過(guò)程中最重要的分子機(jī)制之一。TRPV1通道上與辣椒素、氫離子及高溫激活有關(guān)的位點(diǎn)，通道增敏、脫敏及通道蛋白磷酸化有關(guān)的位點(diǎn)已被揭示。TRPV1通道可被多種不同刺激通過(guò)不同的激活機(jī)制所激活。例如：辣椒

2、素被發(fā)現(xiàn)是通過(guò)結(jié)合在蛋白的胞內(nèi)側(cè)位置激活通道的，而氫離子則是通過(guò)結(jié)合在蛋白的胞外側(cè)激活通道的。TRPV1通道的一個(gè)顯著性特征是該通道活性可以發(fā)生增敏或脫敏。這個(gè)特征提示TRPV1通道功能可以被廣泛調(diào)節(jié)，從而在特定的生理及病生理情況下發(fā)揮作用。
　　電壓門控型鉀離子通道Kv7家族由KCNQ基因編碼。至今為止，共發(fā)現(xiàn)這個(gè)家族的五個(gè)成員：Kv7.1-Kv7.5(KCNQ1-KCNQ5)。KCNQ1編碼的Kv7.1主要表達(dá)于心肌細(xì)胞，Kv

3、7.1/KCNE1被認(rèn)為是心臟IKs的分子學(xué)基礎(chǔ)，在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程中發(fā)揮著重要作用。Kv7.2及Kv7.3被認(rèn)為是神經(jīng)元M電流主要的分子學(xué)基礎(chǔ)，M電流在調(diào)控痛覺(jué)感受神經(jīng)元興奮性中發(fā)揮著重要的作用。KCNQ4編碼的Kv7.4主要表達(dá)于內(nèi)耳和聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)，近來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)顯示KCNQ4基因在大鼠及人的多種血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓大鼠胸主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈的KCNQ4基因的mRNA水平及蛋白水平均大大

4、降低。KCNQ5編碼的Kv7.5廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，被認(rèn)為也參與構(gòu)成了M電流。研究發(fā)現(xiàn)KCNQ1、KCNQ4和KCNQ5在多種血管平滑肌細(xì)胞中高表達(dá)，而KCNQ2和KCNQ3則幾乎無(wú)表達(dá)。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明Kv7鉀離子通道在調(diào)節(jié)血管平滑肌收縮中發(fā)揮著重要作用。
　　本研究論文以上述幾種通道為出發(fā)點(diǎn)，利用電生理膜片鉗、雙電極電壓鉗、基因突變等技術(shù)手段，系統(tǒng)研究了以下幾方面內(nèi)容：(1)1，2-二苯乙烯衍生物對(duì)大鼠DRG神經(jīng)元上的

5、TRPV1通道功能的影響及機(jī)制；(2)鞣酸抑制大鼠DRG神經(jīng)元興奮性及其機(jī)制；(3)鞣質(zhì)類化合物對(duì)Kv7鉀離子通道的調(diào)節(jié)；(4)細(xì)胞膜去極化對(duì)細(xì)胞PIP2水平及Kv7.2/7.3通道電流的影響及機(jī)制。論文具體內(nèi)容如下：
　　第一部分1，2-二苯乙烯衍生物對(duì)大鼠DRG神經(jīng)元上的TRPV1通道功能的影響及機(jī)制
　　目的：在分離培養(yǎng)的成年大鼠DRG神經(jīng)元及HEK293細(xì)胞上研究傳統(tǒng)的氯離子通道阻斷劑1，2-二苯乙烯衍生物DIDS和

6、SITS對(duì)辣椒素(CAP)和低pH引發(fā)的TRPV1功能的調(diào)節(jié)。
　　方法：利用電生理穿孔膜片鉗技術(shù)，在有鈣外液和無(wú)鈣外液情況下觀察1，2-二苯乙烯衍生物DIDS和SITS對(duì)TRPV1通道電流的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：(1)在成年SD大鼠DRG神經(jīng)元上，DIDS可增大辣椒素引發(fā)的TRPV1電流。DIDS對(duì)CAP引發(fā)的TRPV1電流的增大作用具有濃度依賴性，其EC50值為4.66±0.77μM。飽和濃度的DIDS可使CAP引發(fā)的T

7、RPV1電流平均增大2倍以上。單獨(dú)應(yīng)用DIDS并不能引發(fā)任何內(nèi)向電流。DIDS不影響CAP引發(fā)的TRPV1電流的快速脫敏反應(yīng)。DIDS可加快CAP引發(fā)的TRPV1電流的激活時(shí)程。(2)在細(xì)胞外液無(wú)Ca2+條件下，DIDS增大CAP引發(fā)的TRPV1電流的量效關(guān)系，其EC50為4.88±0.74μM，與在有Ca2+條件下測(cè)得的EC50無(wú)明顯差異。(3)DIDS(10μM)可很大程度地增大內(nèi)源性配體anandamide引發(fā)的TRPV1電流，但

8、不影響電流的快速脫敏反應(yīng)。(4)DIDS可濃度依賴性地增大低pH引發(fā)的TRPV1電流，EC50值為1.83±0.29μM。飽和濃度的DIDS(10μM)可使低pH引發(fā)的TRPV1增大448±69％。DIDS可阻斷多次給予低pH刺激引發(fā)的TRPV1電流的快速脫敏反應(yīng)。DIDS可加快低pH引發(fā)的TRPV1電流激活的時(shí)程。(5)DIDS可增大低pH刺激引發(fā)的內(nèi)向電流由TRPV1通道介導(dǎo)，而與其它的酸敏感通道無(wú)關(guān)。(6)DIDS增大TRPV1通

9、道的作用與其水解產(chǎn)物無(wú)關(guān)。(7)SITS不能增大CAP引發(fā)的TRPV1電流的作用，可選擇性的增大低pH引發(fā)的TRPV1電流。(8)DIDS可增大表達(dá)于HEK293細(xì)胞中的TRPV1電流。在細(xì)胞外液無(wú)Ca2+的條件下，DIDS增大CAP引發(fā)的TRPV1電流作用的EC50為3.21±0.10μM。DIDS(100μM)可使CAP激活TRPV1電流的量效曲線顯著左移。DIDS使得TRPV1半最大激活電壓(V1/2)由40±5 mV左移至-42

10、±7 mV。(9)DIDS不是通過(guò)已知的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)增大TRPV1電流。
　　結(jié)論：(1)在成年SD大鼠DRG神經(jīng)元上，DIDS可增大辣椒素引發(fā)的TRPV1電流。(2)在細(xì)胞外無(wú)Ca2+情況下，DIDS對(duì)CAP引發(fā)的TRPV1電流的作用與在有Ca2+情況下的作用相似。(3)DIDS也能增大vanilloid受體內(nèi)源性配體anandamide引發(fā)的TRPV1電流。(4)DIDS可增大低pH刺激引發(fā)的TRPV1電流，并阻斷多次給予低pH刺

11、激引發(fā)的TRPV1電流的快速脫敏反應(yīng)。(5)DIDS增大的低pH刺激引發(fā)的內(nèi)向電流由TRPV1通道介導(dǎo)，而與其它的酸敏感通道無(wú)關(guān)。(6)DIDS增大TRPV1通道的作用與其水解產(chǎn)物無(wú)關(guān)。(7)SITS可選擇性地增大低pH引發(fā)的TRPV1電流。(8)DIDS可增大表達(dá)于HEK293細(xì)胞中的TRPV1電流。(9)DIDS不是通過(guò)已知的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)增大TRPV1電流。
　　第二部分鞣酸抑制大鼠DRG神經(jīng)元興奮性及其機(jī)制
　　目的：研究

12、鞣酸對(duì)大鼠小直徑背根神經(jīng)元興奮性的影響及其離子機(jī)制。
　　方法：利用電生理穿孔膜片鉗技術(shù)，觀察鞣酸對(duì)小直徑背根神經(jīng)元興奮性及離子電流的影響。
　　結(jié)果：(1)1μM、10μM鞣酸可以顯著抑制小直徑背根神經(jīng)元自發(fā)性重復(fù)放電，并且延長(zhǎng)動(dòng)作電位之間的間隔。另外，可以觀察到retigabine導(dǎo)致膜電位超極化，但鞣酸并沒(méi)有影響細(xì)胞靜息膜電位水平。(2)細(xì)胞外給予鞣酸可快速、可逆地增大Kv7/M電流。鞣酸達(dá)到其最大穩(wěn)態(tài)作用約需2分鐘的

13、時(shí)間。鞣酸增大Kv7/M電流的作用具有濃度依賴性，其半數(shù)有效濃度為4.4±0.1μM。飽和濃度的鞣酸可使Kv7/M電流增大約一倍。(3)鞣酸可濃度依賴性增大外源性表達(dá)于HEK293細(xì)胞上的Kv7.2和Kv7.2/7.3鉀離子通道電流，其半數(shù)有效濃度分別為5，40±0.82μM、7.38±1.57μM。飽和濃度的鞣酸可使Kv7.2及Kv7.2/7.3鉀離子通道電流增大2倍以上。鞣酸(10μM)可以增大Kv7.2(W236L)鉀離子通道電流

14、，增大的幅度與野生型Kv7.2鉀離子通道電流無(wú)區(qū)別(Kv7.2 WT：1.34±0.04；Kv7.2(W236L)：1.53±0.20)。這說(shuō)明鞣酸與retigabine增大Kv7.2鉀離子通道電流的機(jī)制不同，Trp236不是鞣酸作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。(4)鞣酸(10μM)可迅速逆轉(zhuǎn)緩激肽引發(fā)的神經(jīng)元興奮性增高。鞣酸可以逆轉(zhuǎn)Kv7/M阻斷劑XE991(3μM)引發(fā)的神經(jīng)元興奮性增高。這個(gè)結(jié)果提示，鞣酸抑制神經(jīng)元興奮性可能是通過(guò)作用于多靶點(diǎn)而發(fā)

15、揮作用的。(5)鞣酸劑量依賴性地抑制小直徑DRG神經(jīng)元上TTX敏感的電壓門控性鈉電流，其半數(shù)有效濃度分別為5.25±0.26μM。飽和濃度的鞣酸可100%阻斷TTX敏感的Na+電流。(6)鞣酸劑量依賴性抑制小直徑DRG神經(jīng)元上外向鉀電流。飽和濃度的鞣酸可以抑制-50%的外向K+電流，其作用的半數(shù)有效濃度為6.55±1.18μM。
　　結(jié)論：(1)鞣酸顯著抑制小直徑DRG神經(jīng)元自發(fā)性重復(fù)放電。(2)鞣酸可劑量依賴性增大小直徑DRG神

16、經(jīng)元上表達(dá)的Kv7/M型鉀電流。(3)鞣酸可濃度依賴性增大外源性表達(dá)于HEK293細(xì)胞上的Kv7.2和Kv7.2/7.3鉀離子通道電流。(4)鞣酸可抑制緩激肽引發(fā)的小直徑DRG神經(jīng)元的興奮性增高。(5)鞣酸劑量依賴性抑制小直徑DRG神經(jīng)元上TTX敏感的電壓門控性鈉電流。(6)鞣酸劑量依賴性抑制小直徑DRG神經(jīng)元上外向鉀電流。
　　第三部分鞣質(zhì)類化合物對(duì)Kv7鉀離子通道的調(diào)節(jié)
　　目的：研究鞣質(zhì)類化合物對(duì)HEK293細(xì)胞上表達(dá)

17、的Kv7鉀離子通道電流的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：利用電生理穿孔膜片鉗技術(shù)，觀察鞣質(zhì)類化合物對(duì)Kv7鉀離子通道電流的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：(1)鞣酸可增大外源性表達(dá)于HEK293細(xì)胞上的Kv7.1/KCNE1鉀離子通道電流，其半數(shù)有效濃度為5.16±0.43μM。飽和濃度的鞣酸可使Kv7.1/KCNE1鉀離子通道電流增大2倍以上。并且，鞣酸使Kv7.1/KCNE1鉀離子通道電流在-40 mV在記錄得到的去激活尾電流時(shí)程明顯減慢。

18、(2)10μM鞣酸可抑制豚鼠心室肌細(xì)胞IKs電流。(3)鞣酸可劑量依賴性地抑制外源性表達(dá)于HEK293細(xì)胞上的Kv7.1鉀離子通道電流。鞣酸可劑量依賴性地增大Kv7.3/7.5鉀離子通道電流。鞣酸對(duì)Kv7.3/7.5鉀離子通道電流的激活作用可能參與介導(dǎo)了鞣酸的擴(kuò)血管作用。(4)鞣酸可劑量依賴性地增大外源性表達(dá)于HEK293細(xì)胞上的Kv7.4鉀離子通道電流，其半數(shù)有效濃度為27.3±3.6μM。飽和濃度的鞣酸可使Kv7.4鉀離子通道電流增

19、大約4倍。鞣酸對(duì)Kv7.4鉀離子通道電流的激活作用可能參與介導(dǎo)了鞣酸的擴(kuò)血管作用。(5)10μM的槲皮素、10μM兒茶素及10μM白藜蘆醇均不影響Kv7.1/KCNE1鉀離子通道電流。(6)10μM槲皮素、10μM鞣酸、10μM Retigabine分別可使Kv7.2/7.3鉀離子通道電流增大128±18%、130±13%、243±31%。10μM兒茶素抑制Kv7.2/7.3鉀離子通道電流，抑制率為40±8%。10μM白藜蘆醇對(duì)Kv7.

20、2/7.3鉀離子通道電流有輕微的增大作用，但與基礎(chǔ)值相比無(wú)顯著性差異(16±6%)。(7)10μM槲皮素、10μM鞣酸、10μM Retigabine分別可使Kv7.4鉀離子通道電流增大87±10%、146±46%、297±13%。10μM兒茶素及10μM白藜蘆醇不影響Kv7.4鉀離子通道電流。
　　結(jié)論：(1)鞣酸增大外源性表達(dá)于HEK293細(xì)胞上的Kv7.1/KCNE1鉀離子通道電流，且這種抑制作用具有劑量依賴性。(2)鞣酸抑

21、制豚鼠心室肌細(xì)胞IKs電流。(3)鞣酸抑制外源性表達(dá)于HEK293細(xì)胞上的Kv7.1鉀離子通道電流，增大Kv7.3/7.5鉀離子通道電流。(4)鞣酸增大外源性表達(dá)于HEK293細(xì)胞上的Kv7.4鉀離子通道電流。(5)槲皮素、兒茶素及白藜蘆醇均不影響Kv7.1/KCNE1鉀離子通道電流。(6)槲皮素可增大Kv7.2/7.3鉀離子通道電流。兒茶素可抑制Kv7.2/7.3鉀離子通道電流。白藜蘆醇不影響Kv7.2/7.3鉀離子通道電流。(7)槲

22、皮素可增大Kv7.4鉀離子通道電流。兒茶素及白藜蘆醇不影響Kv7.4鉀離子通道電流。
　　第四部分細(xì)胞膜去極化對(duì)細(xì)胞膜PtdIns(4，5)P2水平及Kv7.2/7.3鉀離子通道電流的影響及機(jī)制
　　目的：研究細(xì)胞膜電位去極化對(duì)細(xì)胞膜PIP2調(diào)節(jié)的分子學(xué)機(jī)制。
　　方法：利用雙電極電壓鉗技術(shù)及薄層色譜技術(shù)觀察膜電位去極化對(duì)外源性表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的Kv7.2/7.3，Kir2.1，Kir2.3鉀離子通道電流及細(xì)胞

23、膜PIP2的調(diào)節(jié)。
　　結(jié)果：(1)細(xì)胞膜電位去極化可增大外源性表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的Kv7.2/7.3鉀離子通道電流。膜電位去極化增大Kv7.2/7.3鉀離子通道電流具有電壓依賴性，其半最大激活電壓(V1/2)為-26.1±0.5 mV。Kv7.2/7.3鉀離子通道激活和去活時(shí)程在長(zhǎng)時(shí)間膜電位去極化鉗制(0 mV，15 min)前后無(wú)改變(激活時(shí)間常數(shù)分別為：172±4 ms，177±7 ms；去活時(shí)間常數(shù)分別為：163±3

24、 ms，162±10 ms)。膜電位去極化不影響Kv7.2/7.3鉀離子通道電流的電導(dǎo).電壓關(guān)系曲線。長(zhǎng)時(shí)間膜電位去極化(0 mV，15 min)鉗制前后，Kv7.2/7.3鉀離子通道電流的電導(dǎo)-電壓關(guān)系曲線未發(fā)生位移(15min前后分別為-28.7±0.5 mV，-29.6±0.4 mV)。(2)單獨(dú)表達(dá)的Kv7.2鉀離子通道電流同樣具有電壓依賴性的特點(diǎn)。與Kv7.2/7.3鉀離子通道電流相比，去極化鉗制使Kv7.2鉀離子通道電流增大

25、幅度更大。但二者的電壓依賴性特點(diǎn)無(wú)差異，其半最大激活電壓分別為Kv7.2：-29.1±2.4 mV，Kv7.2/7.3：-26.1±0.5 mV。(3)ND96K細(xì)胞外液孵育卵母細(xì)胞15 min可以增大Kv7.2/7.3鉀離子通道電流。ND96K細(xì)胞外液孵育引起的電流增大幅度與低鉀ND96下電壓鉗制在0 mV(15 min)無(wú)明顯差異(ND96K細(xì)胞外液孵育組電流增大183±4%，0 mV電壓鉗制組電流增大205±6%)。高鉀引起的膜電

26、位去極化不影響Kv7.2/7.3鉀離子通道的激活特性(15 min前后分別為V1/2=-28.7±0.3 mV，V1/2=-27.2±0.5 mV)。以上結(jié)果提示膜電位去極化本身可增大Kv7.2/7.3鉀離子通道電流，與鉀離子外流增加無(wú)關(guān)。(4)Kv7.2/7.3鉀離子通道電流可在Ci-VSP去活后迅速恢復(fù)。激活Ci-VSP后雖然使Kv7.2/7.3鉀離子通道電流迅速降低，但并未阻斷膜電位去極化引起的電流增加。薄層色譜(TLC)的方法檢

27、測(cè)到與對(duì)照組相比，高鉀外液孵育15 min和膜電位去極化鉗制在0 mV，15 min，可分別使細(xì)胞膜PIP和PIP2水平增大49±4%和43±7%、71±9%和55±10%。膜電位長(zhǎng)時(shí)間鉗制在去極化電壓可使Kir2.1及Kir2.3鉀離子通道電流顯著增大。并且，與Kir2.1鉀離子通道電流相比，膜電位去極化引起的Kir2.3鉀離子通道電流增大幅度更大。Kir2.3鉀離子通道電流增至初始值的94±8%，Kir2.1增至初始值的53±8%。

28、這個(gè)結(jié)果與之前發(fā)現(xiàn)的Kir2.3鉀離子通道蛋白與PIP2的親和力小于Kir2.1通道蛋白相吻合。這部分研究結(jié)果表明膜電位去極化引起的Kv7.2/7.3鉀離子通道電流增大是通過(guò)提高細(xì)胞膜PIP2水平實(shí)現(xiàn)的。(5)PI4-激酶的阻斷劑wortmannin預(yù)孵育卵母細(xì)胞10 min，可顯著抑制膜電位去極化對(duì)Kv7.2/7.3鉀離子通道電流的增大作用。雙鏈RNA干擾(PI4-Kβ)技術(shù)抑制膜電位去極化引發(fā)的PI4激酶的表達(dá)，并可完全阻斷膜電位去

29、極化引發(fā)的Kv7.2/7.3鉀離子通道電流的增大。此外，雙鏈RNA同樣可抑制膜電位去極化引發(fā)的細(xì)胞膜PIP2的提高。(6)與處于靜息條件下的細(xì)胞(鉗制在-70 mV，0 Hz)比較，低頻率(10 Hz)的生理性膜電位活動(dòng)(模擬神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?可以增大Kv7.2/7.3鉀離子通道電流。高頻率刺激(20 Hz)可使Kv7.2/7.3鉀離子通道電流增至更高的水平。
　　結(jié)論：(1)膜電位去極化可增大外源性表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的Kv7

30、.2/7.3鉀離子通道電流但不影響Kv7.2/7.3鉀離子通道電流動(dòng)力學(xué)時(shí)程及電導(dǎo)-電壓關(guān)系曲線。(2)膜電位去極化引起的Kv7.2/7.3鉀離子通道電流增大具有亞基特異性的特點(diǎn)。(3)高鉀外液孵育可使膜電位去極化并增大Kv7.2/7.3鉀離子通道電流。(4)膜電位去極化引起的Kv7.2/7.3鉀離子通道電流增大是通過(guò)提高細(xì)胞膜PIP2水平實(shí)現(xiàn)的。(5)膜電位去極化引起的細(xì)胞膜PIP2水平升高是由于激活了PI4-激酶引起的。(6)模擬動(dòng)