G蛋白耦聯(lián)受體激動劑調(diào)節(jié)細胞膜PIP2代謝及生理學意義的研究.pdf

1、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(Phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2)是分布在細胞膜內(nèi)側(cè)面的一種微量磷脂，其含量約占細胞膜磷脂總量的1％。雖然含量很低，但PIP2在細胞信號轉(zhuǎn)導、錨定骨架蛋白以及激活或穩(wěn)定膜蛋白等方面卻起著舉足輕重的作用。因此在不同的組織器官中PIP2代謝水平的改變可能與疾病的發(fā)生有關(guān)。
　　PIP2是磷脂酰肌醇(PI)在肌醇環(huán)4位和5位磷酸化的產(chǎn)物。一方面，在細胞信號轉(zhuǎn)

2、導中它可以被激活的磷脂酶C(PLC)水解生成二脂酰甘油(DAG)和肌醇1，4，5-三磷酸(IP3);也可以被磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)磷酸化成為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)，后者是激活PI3K/Akt細胞生存通路的關(guān)鍵信號分子。另一方面，磷脂酰肌醇-4-激酶(PI4K)可以將細胞中的PI磷酸化成為磷脂酰肌醇-4-磷酸(PI4P)，后者則會被細胞膜上的磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶(PIP5K)磷酸化從而完成PIP2的

3、合成。
　　除酪氨酸激酶通路外，PLC的激活一般是通過Gq蛋白耦聯(lián)受體(GqPCR)介導的。兒茶酚胺類化合物、血管緊張素Ⅱ等激素能夠激活細胞膜上的GqPCR。激活的Gq蛋白的α亞基與βγ亞基分離，GTP水解釋放的能量將PLC激活，后者完成PIP2的水解。在較短時間內(nèi)PIP2通過水解局部的再合成機制來維持自身含量水平的穩(wěn)定，在加大刺激強度并延長刺激時間的情況下細胞中PIP2的水平則可能發(fā)生改變。與短時刺激造成的局部影響不同，在增大作

4、用濃度或延長刺激時間的情況下，G蛋白耦聯(lián)受體激動劑能夠增加成年大鼠心肌細胞或腦組織中PIP2的含量。許多重要的體內(nèi)活性物質(zhì)都是G蛋白耦聯(lián)受體激動劑，這些活性物質(zhì)往往在疾病狀態(tài)下發(fā)生改變，因此在疾病的發(fā)生過程中相應細胞中PIP2的代謝狀態(tài)也可能發(fā)生改變。所以，研究在這些情況下PIP2的代謝特征對于探究疾病的發(fā)生機制以及尋找可能的治療方法十分有意義。本研究首先針對去甲腎上腺素和血管緊張素Ⅱ?qū)π募IP2代謝的影響及機制，以及這些作用與心肌肥

5、厚、心臟功能之間的關(guān)系進行了研究;此外還研究了去甲腎上腺素和5-羥色胺對腦PIP2相關(guān)代謝機制的影響及其與抑郁癥的相關(guān)性。研究結(jié)果表明，在激動劑刺激的過程中PIP2合成酶PI4K與PIP5K的活性發(fā)生變化是PIP2含量改變的原因;而且，這種PIP2含量的改變可能是細胞在激動劑刺激下為維持自身功能正常而做出的一種適應性改變。具體的研究內(nèi)容如下:
　　第一部分去甲腎上腺素和血管緊張素Ⅱ?qū)Υ笫笮募〖毎IP2以及心肌功能的調(diào)節(jié)

6、　　目的:早在上個世紀研究者們就發(fā)現(xiàn)了Gq蛋白耦聯(lián)受體激動劑對細胞膜磷脂酰肌醇代謝的調(diào)節(jié)作用，然而對其中具體的調(diào)節(jié)機制和生理意義卻仍不清楚。本部分實驗對Gq蛋白耦聯(lián)受體激動劑去甲腎上腺素(NE)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)調(diào)節(jié)大鼠心肌細胞膜PIP2代謝的分子機制進行深入研究，并初步探討了PIP2代謝改變對心肌細胞功能的影響及其與心肌肥厚發(fā)展不同階段的相關(guān)性。
　　方法:分離大鼠心室肌細胞，使用薄層色譜(TLC)和脂-蛋白交疊分析(L

7、ipid-protein overlay assay, LPOA)的方法來分析NE、AngⅡ?qū)π募〖毎鸓IP2含量的影響;以Gq/PLC通路相關(guān)信號分子特異性抑制劑—U73122（抑制PLC活性）和bisindolylmaleimide-1（Bis-1）（抑制PKC活性）預處理細胞，以PIP2合成酶抑制劑wortmannin、PIK93以及腺苷(adenosine)預處理細胞，再按照前面所述的方法分析NE、AngⅡ刺激后心肌細胞中PIP

8、2的含量變化;利用免疫共沉淀的方法檢測激動劑刺激后PIP2合成酶PI4K與蛋白激酶C(PKC)之間的相互作用;使用TLC的實驗方法測定NE、AngⅡ刺激后心肌細胞PIP2水平變化的時程曲線，20分鐘到72小時之間取4-5個時間點進行研究;按照PIP2變化時程曲線的時間點，使用細胞動緣探測系統(tǒng)檢測NE、AngⅡ刺激后心肌細胞收縮功能的變化;建立大鼠游泳致心肌肥厚以及異丙腎上腺素(isoprenaline)注射致心肌肥厚的實驗模型，使用LP

9、OA的實驗方法測定在生理性心肌肥厚以及病理性心肌肥厚的不同條件下大鼠心室肌中PIP2總含量。
　　結(jié)果:(1)原代心肌細胞培養(yǎng)24小時后，再以NE(5μM)刺激2小時，或以AngⅡ(3μM)刺激24小時，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)刺激后心肌細胞中PIP2的含量明顯增加，使用α受體抑制劑—prazosin（3μM）或AT1受體抑制劑—losartan(3μM)處理細胞能夠拮抗NE或AngⅡ?qū)IP2含量的增加作用;(2)以U73122（0.8μM）

10、、U73343（U73122的同形無效物）、Bis-1（2μM）以及wortmannin（10μM）預處理細胞20-30分鐘，再以NE（5μM，2h）、AngⅡ（3μM，24 h）刺激細胞，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)U73122、Bis-1和wortmannin均能夠抑制NE或AngⅡ?qū)π募〖毎鸓IP2以及PIP含量的增加作用;(3)以Ⅲ型PI4K的抑制劑—PIK93(250 nM)或Ⅱ型PI4K的抑制劑—adenosine(2μM)提前30分鐘處理細

11、胞，再給予NE（5μM，2h）、AngⅡ(3μM，24 h)孵育，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)只有PIK93對NE或AngⅡ引起的PIP2含量增加具有明顯的抑制作用并且顯著降低了細胞中PIP的水平。單獨給予細胞PIK93或adenosine，PIK93對心肌細胞中PIP2以及PIP的含量均無明顯影響，但adenosine則顯著下調(diào)了細胞中PIP2以及PIP的含量水平;(4)NE（5μM）、AngⅡ（3μM）以及PKC激動劑佛波酯（PMA，0.5μM）均能

12、夠增加PI4KⅢβ與PKCα之間、PI4KⅢβ與PKCβ之間的相互作用，而在心肌細胞中PI4KⅢα與PKCs之間并無明顯的相互作用;(5)當刺激心肌細胞24小時以后，NE或AngⅡ?qū)IP2含量的增加作用隨刺激時間的延長而逐漸降低，甚至可能逆轉(zhuǎn)為降低作用。與此同時，對應時間點上心肌細胞的收縮功能也出現(xiàn)與PIP2含量類似的變化;(6)使用LPOA的方法測定兩種心肌肥厚動物模型心臟中PIP2的含量，相比正常動物，游泳致心肌肥厚大鼠心臟中PI

13、P2的含量水平并無較大改變，而Iso注射組大鼠心臟中PIP2的含量卻顯著減少。
　　結(jié)論:NE和AngⅡ激動Gq蛋白耦聯(lián)受體，并通過受體激動后的下游信號通路水解PIP2，同時激活PIP2的再合成。PKC與PI4KⅢβ之間的相互作用是連接PIP2水解與再合成通路的分子基礎(chǔ)。通過對心肌細胞收縮功能以及兩種不同心肌肥厚模型的研究我們發(fā)現(xiàn)，在應激刺激下PIP2含量的增加可能與心肌肥厚初期心臟的代償功能有關(guān)。
　　第二部分 PIP5K

14、γ在G蛋白耦聯(lián)受體調(diào)節(jié)大鼠心肌細胞膜PIP2中的作用
　　目的:了解磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶(PIP5K)在去甲腎上腺素(NE)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及異丙腎上腺素(Iso)等G蛋白耦聯(lián)受體激動劑在調(diào)節(jié)心肌細胞PIP2代謝中的作用及細胞信號機制。
　　方法:利用western blot的方法檢測PIP5Kγ的表達水平;使用TLC的實驗方法測定心肌細胞中PIP2的含量水平，觀察NE、AngⅡ及Iso對心肌細胞PIP2

15、含量的影響;使用藥理學手段了解上述激動劑影響心肌細胞中PIP5Kγ的表達以及PIP2的含量的信號機制;使用蛋白合成酶抑制劑放線菌酮(cycloheximide)處理細胞，通過測定激動劑刺激后心肌細胞PIP2含量的改變，并以此來分析激酶表達與PIP2合成之間的聯(lián)系;利用免疫共沉淀的方法檢測激動劑刺激后PIP2合成酶PIP5Kγ與其水解酶PLC之間的相互作用。
　　結(jié)果:(1)NE（5μM）、AngⅡ（3μM）、PMA（0.5μM）以

16、及β受體激動劑isoprenaline(0.5μM)均能夠增加心肌細胞中PIP5Kγ的表達量，但NE與Iso的增加作用要顯著大于AngⅡ與PMA的作用;(2)使用propranolol(3μM)抑制β受體或使用H89(30μM)抑制Gs蛋白耦聯(lián)受體信號通路下游效應分子PKA，均能夠抑制激動劑對PIP5Kγ表達水平的上調(diào)作用，但prazosin和Bis-1卻對此無效;(3)β受體拮抗劑propranolol預處理細胞30分鐘能夠抑制NE對

17、PIP2的增加作用。與NE類似，Iso也能夠增加心肌細胞中PIP2的含量，但對PIP的含量卻無明顯影響;(4) Cycloheximide不僅能夠抑制NE引起的PIP5Kγ表達量的增加，也能夠顯著降低心肌細胞中PIP2的含量并抑制NE的作用;(5)NE（5μM）、AngⅡ（3μM），以及Iso（0.5μM）均能夠增強PIP2合成酶PIP5Kγ與水解酶PLCγ之間的相互作用。
　　結(jié)論:NE、Iso激動Gs蛋白耦聯(lián)受體，并通過提高P

18、IP5Kγ的表達水平來增加細胞中PIP2的再合成。由于能夠同時激活Gq/PLC/PKC與Gs/cAMP/PKA兩條通路，NE引起的PIP2含量增加要明顯快于AngⅡ的作用。
　　第三部分去甲腎上腺素和5-羥色胺對鼠腦PIP2代謝的調(diào)節(jié)以及與抑郁癥的關(guān)系
　　目的:PIP2是突觸囊泡釋放以及回收過程中不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)，它與突觸可塑性之間存在關(guān)系，同時也可能影響突觸間遞質(zhì)的釋放。因此研究腦磷脂酰肌醇特別是PIP2的代謝對于了解

19、疾病狀態(tài)下如抑郁癥的發(fā)病機制以及尋找新的治療手段具有重要意義。去甲腎上腺素(NE)及5-羥色胺(5-HT)是重要的與抑郁癥相關(guān)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。在本研究中我們將研究NE和5-HT對大鼠和小鼠腦PIP2代謝的影響，通過測定給藥后PIP2合成酶PI4K表達水平以及突觸中PIP2含量的變化，初步探究中腦PIP2代謝改變與抑郁癥之間的聯(lián)系。
　　方法:利用western blot的方法檢測NE、5-HT孵育后鼠腦內(nèi)PIP2合成酶—PI4K

20、的表達水平;提取膜蛋白，觀察NE、5-HT孵育后PKC在細胞膜中的表達情況;利用免疫共沉淀的方法檢測NE、5-HT孵育后PI4K與PKC之間的相互作用是否發(fā)生變化;分離突觸小體，利用LPOA的方法(ELISA試劑盒)測定其中PIP2的含量，并觀察NE、5-HT孵育后PIP2水平是否發(fā)生改變;建立小鼠的慢性社交失敗抑郁癥模型，初步研究模擬精神疾病狀態(tài)下鼠腦內(nèi)PI4K的表達狀況。
　　結(jié)果:(1)給予NE（10μM）、5-HT（30μ

21、M）17分鐘后，大鼠中腦切片中總PI4KⅢβ以及膜PI4KⅢβ的表達水平均出現(xiàn)明顯增高;(2)通過使用PKC阻斷劑Bis-1（1.5μM）預處理中腦切片我們發(fā)現(xiàn)，NE、5-HT對PI4KⅢβ表達量的增加作用依賴于PKC的激活;(3)NE、5-HT能夠增強大鼠中腦切片中PI4KⅢβ與PKCα以及PI4KⅢβ與PKCβ之間的相互作用并增加其中腦突觸小體中PIP2的含量;(4)雖然對小鼠中腦區(qū)域PI4K和PKC在的相互作用并無明顯影響，但NE

22、、5-HT能夠顯著降低PI4K和PKC在小鼠前額葉皮層中的相互作用以及該區(qū)域突觸小體中PIP2的水平;(5)社交失敗模型小鼠腦內(nèi)的PI4KⅢβ表達水平下調(diào)。
　　結(jié)論:NE和5-HT能夠促進大鼠中腦PI4K、PIP5K的表達，增強大鼠中腦和前額皮層PI4K與PKC間的相互作用，升高大鼠中腦PIP2水平。相對于大鼠，NE和5-HT對小鼠有不同的作用:只降低前額皮層PI4K與PKC間的相互作用和PIP2水平，而沒有其他上述對大鼠的作用