SM22α和KDR啟動子-增強(qiáng)子基因調(diào)控PI3K信號通路對移植血管新生內(nèi)膜增生的影響.pdf

1、目的：采用組織特異性啟動子SM22α和KDR，結(jié)合RNA干擾原理，構(gòu)建靶向大鼠Pik3cb基因的真核表達(dá)載體，通過Pluronic F-127緩釋系統(tǒng)轉(zhuǎn)染大鼠頸靜脈移植血管，研究其對VSMC、VEC及靜脈移植血管新生內(nèi)膜增生的影響，探索有效防治靜脈移植血管狹窄的新方法，并為預(yù)防血栓形成提供理論依據(jù)。
　　 方法：根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫提供的大鼠PI3K p110β亞單位編碼基因Pik3cb mRNA序列 (NM：053481)

2、，按照shRNA設(shè)計原則，分別構(gòu)建合成含有SM22αp/e、KDR p/e和CMV pGenesil-1的質(zhì)粒表達(dá)載體，并命名為SM22α-Pik3cb-shRNA、KDR-Pik3cb-shRNA和CMV-Pik3cb-shRNA。建立大鼠頸靜脈-動脈移植模型，通過Pluronic F-127質(zhì)粒緩釋系統(tǒng)在血管吻合完成后進(jìn)行局部RNA干擾。實(shí)驗(yàn)分6組，每組30只SD大鼠。A組：對照組（25％ Pluronic F-127組）；B組：K

3、DR-Pik3cb-shRNA組；C組：SM22α-Pik3cb-shRNA組；D組：CMV-Pik3cb-shRNA組；E組：KDR-Pik3cb-shRNA+SM22α-Pik3cb-shRNA混合組；F組：陽性對照組（wortmannin組）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組的不同，將含有50μg shRNA質(zhì)粒，或50μg wortmannin的凝膠，或單純200μL 25％ Pluronic F-127凝膠均勻涂抹在移植靜脈周圍，分別于術(shù)后1d、

4、3 d、7 d、14 d和28 d截取移植血管。HE染色觀察新生內(nèi)膜厚度；免疫組化檢測磷酸化mTOR（Ser2448）；TUNEL法測細(xì)胞凋亡。另設(shè)一組，于術(shù)后3 d取材，熒光定量PCR測定Pik3cb mRNA的相對表達(dá)量。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建大鼠頸靜脈分支-頸動脈間置模型，大體觀察移植血管通暢率， KDR-Pik3cb-shRNA組通暢率最低（23.3％），與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=4.593，P＜0.05）；SM2

5、2α-Pik3cb-shRNA組通暢率最高（86.7％），與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=9.32，P＜0.01）。
　　 術(shù)后3 d，熒光定量PCR檢測Pik3cb mRNA相對表達(dá)量，陽性對照組和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組較對照組明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)意義（F=386.3，P＜0.01）。B組、C組、D組、E組和F組較對照組分別下降了46.8％、73.3％、81.2％、64.2％和68.4％。
　　 術(shù)后1～3 d各組新生內(nèi)膜厚度差別無

6、統(tǒng)計學(xué)意義；術(shù)后7 d各組新生內(nèi)膜比較有統(tǒng)計學(xué)意義（F=82.59，P＜0.01），術(shù)后14 d各組新生內(nèi)膜比較有統(tǒng)計學(xué)意義（F=325.09，P＜0.01），術(shù)后28 d各組新生內(nèi)膜比較有統(tǒng)計學(xué)意義（F=483.76，P＜0.01）；術(shù)后28 d時，對照組新生內(nèi)膜較術(shù)后1d增厚10.4倍；B組、C組、D組、E組和F組分別增厚11.6倍、6.0倍、7.1倍、6.8倍和6.5倍。
　　 陽性對照組和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組移植靜脈磷酸化mTOR

7、（Ser2448）表達(dá)陽性面積均明顯低于正常對照組，有統(tǒng)計學(xué)意義（F=50.41，P＜0.05）；28 d時，B組、C組、D組、E組和F組陽性面積百分比分別為0.93％、0.69％、0.49％、0.47％和0.43％，而對照組陽性百分比為1.48％。
　　 各組術(shù)后不同時間點(diǎn)移植靜脈組織凋亡細(xì)胞陽性面積均明顯高于正常對照組，有統(tǒng)計學(xué)意義(F=134.38，P＜0.05)；14 d時各組凋亡細(xì)胞陽性面積達(dá)高峰，對照組1.27％，B

8、組、C組、D組、E組和F組分別為1.95％、2.43％、3.18％、3.06％和2.94％。
　　 結(jié)論：大鼠頸靜脈分支-頸動脈間置模型是一種研究血管旁路移植術(shù)后橋血管狹窄的理想模型；SM22α-Pik3cb-shRNA可抑制血管新生內(nèi)膜增生，其作機(jī)制可能是下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞PI3K-Akt-mTOR信號通路而抑制血管平滑肌細(xì)胞增值并促進(jìn)其凋亡；KDR-Pik3cb-shRNA可導(dǎo)致移植血管血栓形成，增加移植血管新生內(nèi)膜厚度，其