Gibson Assembly改良分子克隆系統(tǒng)構(gòu)建及應用與黑素母細胞SV40T重編程的研究.pdf

1、本課題研究包含了三個分子克隆系統(tǒng)改建的技術(shù)性課題，兩個黑色素瘤基因治療的課題和一個黑色素瘤全基因組耐藥基因篩查的課題，這三個課題同時也是三個技術(shù)課題成果的應用和進一步證明。此外還在課題組原有的黑色素母細胞可逆性永生化的研究基礎(chǔ)上進行了SV40-T抗原對黑色素母細胞永生化重編程的研究。各個部分課題相對獨立完整又相互關(guān)聯(lián)。
　　Daniel Gibson開發(fā)的Gibson DNA Assembly是一種基于雙鏈DNA分子同源序列進行無

2、縫拼接的DNA連接方式，相較于傳統(tǒng)的基于內(nèi)切酶位點的分子克隆連接方式有其獨特的優(yōu)勢。本研究基于DNA Gibson Assembly法，突破以往分子克隆的多種局限性，進行了三種分子克隆技術(shù)的革新:一、發(fā)明了無需重組的腺病毒構(gòu)建系統(tǒng);二、創(chuàng)建了多段干擾序列一步合成共表達的siRNA表達系統(tǒng);三、建成了低成本，全基因組覆蓋，簡便易行，隨機無偏性的siRNA文庫。
　　本課題組在黑色素細胞的干細胞生物學，腫瘤生物學方面有多年的研究積累。

3、技術(shù)的開發(fā)是為了應用，上述分子克隆表達系統(tǒng)構(gòu)建完成后，我們將這些技術(shù)探索性地用于黑色素瘤基因治療和耐藥靶點篩查的研究，一方面在科研實踐中驗證所革新技術(shù)的功能，另一方面借助新的工具在黑色素瘤治療，黑色素瘤耐藥領(lǐng)域做一些分子機制研究，希望能為黑色素瘤基因治療，抗耐藥基因篩查的科研與臨床實踐提供新的方法和理論依據(jù)。
　　此外，基于實驗室的黑素母細胞可逆性永生化研究基礎(chǔ)，從新發(fā)現(xiàn)的黑素母細胞永生化細胞株在體生成畸胎瘤樣組織塊現(xiàn)象出發(fā)，圍繞

4、SV40-T抗原對黑素母細胞的重編程現(xiàn)象和機制展開研究，一方面進一步明確SV40-T抗原黑素母細胞永生化細胞系的的可行性，安全性及其他可能的潛能。另一方面為傳統(tǒng)的SV40-T抗原永生化細胞技術(shù)補充理論依據(jù)。
　　主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1.構(gòu)建了無穿梭質(zhì)粒腺病毒過表達載體pROS和pGOS，以pROS為載體，以GFP為目的基因進行Gibson Assembly連接，成功繞開穿梭質(zhì)粒和重組的步驟，直接將目的基因連接到完整的腺

5、病毒骨架上。此法獲得陽性克隆的效率大于70％，構(gòu)建的腺病毒質(zhì)粒能順利包裝成腺病毒并進行擴增，病毒感染細胞后能高效率表達綠色熒光。這種無穿梭質(zhì)粒腺病毒構(gòu)建方法效率高，流程簡單，成本低，避免了重組步驟中突變的高風險，對目的基因選擇范圍大，是一種優(yōu)越的腺病毒包裝新技術(shù)。
　　2.構(gòu)建了多段序列siRNA一步合成逆轉(zhuǎn)錄病毒骨架(pSOK)，腺病毒骨架（pAdTrace-OK，pAdTrack-OK）和Piggy-bac質(zhì)粒骨架(pBOK)

6、。設(shè)計構(gòu)建了含有H1，U6背靠背序列的pB2B質(zhì)粒用于多段序列siRNA嵌入序列的制備。用pSOK為代表，以beta-catenin干擾做測試，發(fā)現(xiàn)該方法能夠短時間，低成本，高效率獲得多個干擾片段同時連接到同一載體的克隆，在多個人和小鼠細胞系的體內(nèi)體外實驗中證實該法合成的多序列siRNA表達系統(tǒng)能高效率發(fā)揮沉默目的基因的功能。是一種優(yōu)良的基因沉默新方法。
　　3.以逆轉(zhuǎn)錄病毒骨架pSOK為載體，化學合成法隨機合成的19個堿基siR

7、NA片段為嵌入序列，用Gibson DNA Assembly方法進行連接，構(gòu)建出全基因組覆蓋的siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒隨機文庫。經(jīng)菌落PCR，克隆計數(shù)，測序，感染后細胞異質(zhì)性克隆生成觀察等方法鑒定，該文庫一次合成克隆數(shù)達到2-3×106，且具有隨機性和異質(zhì)性，單次使用能夠完全覆蓋哺乳動物功能基因表達譜，且操作過程簡單，省時經(jīng)濟，在感染小鼠黑素母細胞系imc23的測試中表現(xiàn)出較高的感染效率和明確的使細胞生成異質(zhì)性克隆的功能。是一種優(yōu)良的siR

8、NA文庫構(gòu)建技術(shù)，科研和臨床應用前景廣闊。
　　4.使用無穿梭質(zhì)粒腺病毒載體構(gòu)建的分泌型IGF-1R結(jié)構(gòu)抑制蛋白表達腺病毒AdRdnIGF-1 Rα和AdRdnIGF-1Rβ可以明顯抑制人和小鼠黑色素瘤的生長，其中AdRdnIGF-1 Rβ的效果更明顯。抑制腫瘤生長的主要原因是促進了黑素瘤細胞的凋亡，也與一定程度上抑制了細胞進入分裂期有關(guān)。提示我們構(gòu)建的分泌型IGF-1R結(jié)構(gòu)抑制蛋白可以作為黑色素瘤基因治療的新的手段，有效抑制黑色

9、素瘤的生長。同時也實踐證明了我們所構(gòu)建的無穿梭質(zhì)粒腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)效率高，易操作，表達目的基因的能力強而穩(wěn)定。
　　5.以之前構(gòu)建的多片段siRNA表達載體pAdTrace-OK為載體，構(gòu)建3個序列IGF-1R干擾腺病毒AdRhIGF1R-OK（人）和AdRmIGF1R-OK（小鼠）。以人黑色素瘤細胞系A(chǔ)375，小鼠黑色素瘤細胞系B16F10為細胞模型，在細胞水平和動物在體水平證明了我們構(gòu)建的多片段siRNA表達載體能高效簡便地構(gòu)建

10、3個序列IGF-1R干擾腺病毒。導入細胞后沉默IGF-1R的效果明顯。IGF-1R多片段siRNA序列干擾腺病毒在細胞與動物水平均能有效抑制黑色素瘤的生長。抑制腫瘤生長的主要原因是促進了黑素瘤細胞的凋亡?？梢宰鳛楹谏亓龌蛑委煹男碌氖侄?。
　　6.我們以人黑色素瘤A375為細胞模型，導入構(gòu)建的全基因組siRNA文庫后針對目前國際一線用抗黑色素瘤藥物建立耐藥細胞克隆。再根據(jù)耐藥克隆中可追蹤的siRNA片段追蹤相對應的抗耐藥基因。目

11、前我們已經(jīng)成功獲得了抗維羅非尼(vemurafenib)的耐藥A375細胞，其耐藥能力穩(wěn)定而強大，能在維羅非尼水相飽和濃度(100uM)的情況下健康存活，而沒有導入siRNA文庫的對照組A375細胞在(25uM)時就沒有細胞存活下來。目前的結(jié)果說明我們構(gòu)建siRNA文庫合成和使用方便，覆蓋率高，隨機性好，導入細胞后能強效發(fā)揮基因沉默的功能，使宿主細胞產(chǎn)生明顯的差異表型?，F(xiàn)在已經(jīng)拿到的耐藥人黑色素瘤細胞克隆是本實驗的限速步驟，這一步的完成

12、一方面證明了我們的實驗方案的可行性，另一方面是后續(xù)的實驗順理成章做下去的關(guān)鍵基礎(chǔ)。有望為維羅非尼的臨床耐藥的機制研究提供新的線索，為新藥改良，補充治療尋找新的靶點。
　　7.證明了SV40-T永生化的黑素母細胞imcx相較原代黑素母細胞發(fā)生了重編程，在發(fā)育階段上更為原始，分化潛能增加，而這一變化與SV40-T相關(guān)。imcx細胞中ips四個因子除Sox2以外均升高，多種多項潛能相關(guān)基因，神經(jīng)脊特異性基因的表達升高，成球能力增強等均提

13、示SV40-T的導入使原代黑素母細胞發(fā)生了去分化，變成了發(fā)育階段上更早期的細胞。黑素譜系分化相關(guān)指標與預期不同，不降反升，可能與重編程后imcx仍能保持強大的向黑色素譜系終末分化的潛能相關(guān)。Sox2在SV40-T介導的黑素母細胞重編程中不是必須的，甚至可能是不被允許高表達的。imcx相較原代黑素母細胞分化潛能增加，具有兩個胚層以上，至少4種細胞分化方向的潛能。imcx高表達三個胚層的一些分子標記，在二維培養(yǎng)和動物在體移植水平證明了imc

14、x具有向黑色素細胞，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細胞，骨組織，脂肪組織的進行終末分化的潛能，在體移植生成的組織塊呈畸胎瘤樣組織學特點。用E2f熒光報告系統(tǒng)，p53熒光報告系統(tǒng)，imcx細胞水平和動物在體水平逐個過表mcx相較原代黑素母細胞分化潛能增加，具有兩個胚層以上，至少4種細胞分化方向的潛能。imcx高表達三個胚層的一些分子標記，在二維培養(yǎng)和動物在體移植水平證明了imcx具有向黑色素細胞，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細胞，骨組織，脂肪組織的進行終末分化的潛

15、能，在體移植生成的組織塊呈畸胎瘤樣組織學特點。過表達達ips4個因子觀察其分化程度和成畸胎瘤能力變化等實驗手段對SV40-T重編程小鼠黑素母細胞的機制進行了初步探索。E2f的升高，p53的降低可能與SV40-T重編程小鼠黑素母細胞相關(guān)。在imcx中各個加入ips四個因子，均會導致細胞水平產(chǎn)黑素量增多，細胞傾向于分化。尤其是Oct4較為明顯。在體移植時，加入不同ips因子的imcx成畸胎瘤的情況出現(xiàn)明顯差異。提示C-Myc與SV40-T有