日本血吸蟲細(xì)胞選擇培養(yǎng)與用SV40大T抗原基因轉(zhuǎn)染的研究.pdf

1、第一章3種選擇培養(yǎng)基用于日本血吸蟲細(xì)胞培養(yǎng)的研究
　　[目的]探索3種選擇培養(yǎng)基對日本血吸蟲(Schistosoma japonicum,S.j)細(xì)胞作選擇培養(yǎng),觀察和鑒定各自對細(xì)胞培養(yǎng)的效果,探索通過選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得單一種類血吸蟲細(xì)胞的可能性。
　　[方法]分別從感染家兔獲取Sj-12d童蟲和42d成蟲,按常規(guī)方法制備細(xì)胞。采用生殖類細(xì)胞改良培養(yǎng)基對Sj-12d童蟲和Sj-42d成蟲細(xì)胞進(jìn)行選擇培養(yǎng);同時采用上皮細(xì)胞培

2、養(yǎng)基和1640-40綜合培養(yǎng)基對S.j-12d童蟲細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。觀察日本血吸蟲細(xì)胞經(jīng)這3種選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)后一般生長狀況和形態(tài)特點;通過染色體核型分析、AKP染色、超微結(jié)構(gòu)觀察對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定;利用BrdU摻入法或3H-TdR摻入法檢測部分培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力,以及運用Dot-ELISA方法檢測培養(yǎng)細(xì)胞的抗原性。
　　[結(jié)果]日本血吸蟲細(xì)胞經(jīng)這3種選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后,均有不同程度的增殖,細(xì)胞分裂相明顯,并且細(xì)胞活力狀態(tài)良好。經(jīng)生殖類

3、細(xì)胞改良培養(yǎng)基培養(yǎng)的童蟲和成蟲來源細(xì)胞在早期分裂現(xiàn)象明顯,呈葡萄串樣生長繁殖,形成細(xì)胞團;第3周可見大量形態(tài)結(jié)構(gòu)相近的細(xì)胞呈半貼壁生長狀態(tài)。對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有DNA合成,染色體具有單倍體和雙倍體兩種核型;AKP染色為強陽性,超微結(jié)構(gòu)鑒定可見胞質(zhì)中含有大量囊泡狀小體,此為生殖類細(xì)胞的特征之一;培養(yǎng)4周細(xì)胞開始出現(xiàn)退化死亡。日本血吸蟲童蟲細(xì)胞經(jīng)上皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果顯示:培養(yǎng)3d的細(xì)胞出現(xiàn)類上皮樣細(xì)胞生長,培養(yǎng)1周呈半貼壁

4、生長;細(xì)胞形態(tài)多呈長梭形,結(jié)構(gòu)完整,核質(zhì)分明,細(xì)胞核清晰可見,核仁明顯;超微結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞膜完整,細(xì)胞器無擴張、水腫現(xiàn)象,核仁和核膜清晰;并且童蟲細(xì)胞成分能被血吸蟲細(xì)胞免疫血清所識別。根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)特征和抗原性,初步認(rèn)為經(jīng)上皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的童蟲細(xì)胞為上皮類細(xì)胞。用1640-40綜合培養(yǎng)基培養(yǎng)的日本血吸蟲細(xì)胞經(jīng)鑒定后結(jié)果顯示:培養(yǎng)細(xì)胞分裂相多樣,培養(yǎng)早期(30d)細(xì)胞狀態(tài)和活力較好,增殖相明顯;超微結(jié)構(gòu)觀察顯示培養(yǎng)30d細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正

5、常,進(jìn)行細(xì)胞活力檢測達(dá)到70％;細(xì)胞增殖試驗結(jié)果顯示細(xì)胞具有一定的增殖能力;染色體分析符合血吸蟲二倍體核型;對細(xì)胞進(jìn)行凍存復(fù)蘇發(fā)現(xiàn)基本保持細(xì)胞原有的特性和活力。
　　[結(jié)論]日本血吸蟲混合細(xì)胞經(jīng)生殖類細(xì)胞改良培養(yǎng)基和上皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后,能使混合細(xì)胞中類似生殖類細(xì)胞和上皮細(xì)胞進(jìn)行選擇性增殖,并具有該類特定細(xì)胞的部分標(biāo)志性特征,可以達(dá)到初步分選細(xì)胞的目的,但連續(xù)培養(yǎng)時間不長。1640-40綜合培養(yǎng)基能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖,改善細(xì)胞生長狀

6、態(tài),延長細(xì)胞在體外的存活時間。
　　第二章SV40大T抗原基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染日本血吸蟲童蟲與其細(xì)胞后的效果觀察
　　[目的]構(gòu)建含SV40大T抗原(SV40LT)基因的重組腺病毒表達(dá)載體,觀察重組腺病毒轉(zhuǎn)染日本血吸蟲童蟲及童蟲細(xì)胞后SV40LT基因的表達(dá)情況,探討重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染日本血吸蟲童蟲和童蟲細(xì)胞的可能性,觀察轉(zhuǎn)染的外源SV40LT基因?qū)νx和童蟲細(xì)胞生長狀況以及細(xì)胞增殖的影響。
　　[方法]將國外贈送的攜帶S

7、V40LT基因的重組腺病毒質(zhì)粒(AdHu5-SV40LT)采用熱休克法重新轉(zhuǎn)化Stb12感受態(tài)菌,獲得重組腺病毒質(zhì)粒。對質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶酶切、PCR擴增法進(jìn)行鑒定。鑒定正確后的質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切線性化后用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,待出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(cell pathological effect,CPE)后收集細(xì)胞,經(jīng)反復(fù)凍融細(xì)胞離心收集細(xì)胞裂解上清,用氯化銫超速離心法對病毒上清進(jìn)行濃縮和純化,獲得具有感染性的重組腺病毒(Ad-SV

8、40LT)。采用50％細(xì)胞培養(yǎng)感染法(50％ cell culture infectious dose,CCID50)測定腺病毒的滴度。日本血吸蟲尾蚴常規(guī)感染家兔獲得12d童蟲,一部分用改良841培養(yǎng)基培養(yǎng),另一部分按常規(guī)方法制備細(xì)胞,添加1640-40綜合培養(yǎng)基培養(yǎng)。兩者均培養(yǎng)3d后用重組腺病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,繼續(xù)培養(yǎng)6～10d分別收集蟲體和細(xì)胞,通過PCR、RT-PCR、Western blotting和免疫組織化學(xué)方法檢測轉(zhuǎn)染童蟲及童蟲

9、細(xì)胞中SV40L瑾因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。
　　[結(jié)果]轉(zhuǎn)化Stb12感受態(tài)菌后提取的AdHu5-SV40LT質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切和PCR鑒定為目的質(zhì)粒。質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞并可在293A細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效的復(fù)制;從轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞裂解上清中提取病毒DNA進(jìn)行PCR檢測證實含有SV40LT目的基因;同時Western blotting結(jié)果顯示在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293A細(xì)胞中有SV40LT蛋白的表達(dá);免疫組織化學(xué)染色也證實了同樣的結(jié)果。腺病毒轉(zhuǎn)

10、染的293A細(xì)胞裂解上清經(jīng)氯化銫超速離心濃縮后測得病毒滴度為2.6×109cfu/ml。常規(guī)制備的S,j-12d童蟲細(xì)胞用1640-40綜合培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后可見細(xì)胞生長狀態(tài)良好,部分細(xì)胞分裂相明顯。用重組腺病毒轉(zhuǎn)染的S.j-12d童蟲及童蟲細(xì)胞經(jīng)PCR檢測均擴增出了外源SV40LT基因558bp的目的產(chǎn)物,進(jìn)一步用RT-PCR也證實了有目的基因mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá);Western blotting檢測結(jié)果顯示重組腺病毒轉(zhuǎn)染的童蟲及其細(xì)胞內(nèi)

11、有SV40LT蛋白的表達(dá);免疫組織化學(xué)染色檢測也證實在蟲體被膜下、口腹吸盤以及童蟲細(xì)胞內(nèi)均有該蛋白的表達(dá)。病毒轉(zhuǎn)染后童蟲活力未受影響,而童蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染初期增殖較快,此后生長逐漸減慢,細(xì)胞出現(xiàn)崩解、死亡。
　　[結(jié)論]用質(zhì)粒AdHu5-SV40LT和脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后,成功獲得了具有感染能力的攜帶外源SV40LT基因的腺病毒;重組腺病毒轉(zhuǎn)染日本血吸蟲童蟲及童蟲細(xì)胞后有目的基因SV40LT的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),但轉(zhuǎn)染的外源SV40L