日本血吸蟲成蟲抗原篩選、鑒定及無細(xì)胞體系表達(dá).pdf

1、血吸蟲病仍然是全球危害最為嚴(yán)重的熱帶病之一。我國(guó)經(jīng)過50多年積極防治，感染率和感染度均已降至較低水平，從人糞便樣本中查找蟲卵等病原學(xué)查病方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且敏感性低，已不再適用于大規(guī)模的人群調(diào)查。血清免疫學(xué)診斷方法具有簡(jiǎn)易、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已在全國(guó)血吸蟲病查治病中起重要作用。目前現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的免疫診斷方法均采用蟲源性粗抗原檢測(cè)抗體，雖然敏感性高，但與其它吸蟲存在交叉反應(yīng)，并且蟲源性抗原還存在來源和標(biāo)準(zhǔn)化困難等問題。血吸蟲基因組和蛋白質(zhì)組

2、研究積累的龐大信息資料，加上免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，為發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲特異性診斷抗原帶來新的生機(jī)。
　　目的：一、應(yīng)用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)整體研究日本血吸蟲成蟲可溶性蛋白質(zhì)中全套抗原，獲得具有診斷價(jià)值的抗原蛋白質(zhì)，以期解決血吸蟲病免疫診斷中抗原特異性問題。二、創(chuàng)建日本血吸蟲抗原蛋白質(zhì)的體外麥胚無細(xì)胞體系表達(dá)方法，以期獲得保持良好抗原性的重組蛋白，解決日本血吸蟲病診斷抗原的來源和標(biāo)準(zhǔn)化難等問題。
　　方法：從人工感染日本血吸

3、蟲的家兔體內(nèi)收集成蟲，用PBS漂洗后在冰浴上研磨成勻漿、超聲粉碎，然后低溫高速離心制備血吸蟲成蟲可溶性蛋白質(zhì)(Soluble adultworm protein，SAWP)。用雙向凝膠電泳（2-DE）分離蛋白質(zhì)，每樣本做3塊平行2-DE膠，一塊膠用于硝酸銀染色，兩塊膠用于轉(zhuǎn)膜作Western blot檢測(cè)。兩張轉(zhuǎn)印膜用5％脫脂奶粉封閉后，分別與健康兔IgG和感染兔IgG孵育，以AP標(biāo)記的抗兔IgG多抗為二抗，用NBT-BCIP進(jìn)行顯色。

4、選出膜上的陽(yáng)性反應(yīng)點(diǎn)，在染色膠找匹配的抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)。膠上的抗原蛋白點(diǎn)經(jīng)挖點(diǎn)、脫色和胰蛋白酶消化后進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定，并通過搜數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得抗原蛋白質(zhì)的相關(guān)信息資料。
　　本研究探索三種免疫捕捉富集抗原的方法。直接免疫捕捉法:分別選用CNBr-activated Sepharose、氨基修飾磁珠和羧基修飾磁珠3種固相載體共價(jià)結(jié)合日本血吸蟲感染兔IgG，以此免疫捕捉SAWP中的抗原蛋白質(zhì)，洗脫液用SDS-PAGE分離

5、蛋白質(zhì)，Western blot檢測(cè)分析富集抗原。間接免疫捕捉法:將SPA與Sepharose共價(jià)結(jié)合制成親和層析柱，先將感染兔血清IgG過柱，SPA特異性結(jié)合兔血清IgG，然后再將SAWP過柱，SPA通過感染兔IgG間接免疫捕捉抗原蛋白質(zhì)，洗脫液用SDS-PAGE分離和Western blot檢測(cè)分析。免疫共沉淀富集抗原:將感染兔血清IgG與SAWP一起孵育，抗原與IgG抗體特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物(IC)，加適量PEG-6000沉淀

6、IC，使抗原從復(fù)雜樣本富集出來，再用SDS-PAGE和Western blot分析富集效果。
　　體外麥胚無細(xì)胞體系表達(dá)體被抗原和ER calcistorin。以日本血吸蟲RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增這兩個(gè)抗原蛋白質(zhì)的ORF;酶切后連接到pIVEX1.4WG載體的多克隆位點(diǎn)，獲得重組表達(dá)載體;麥胚無細(xì)胞表達(dá)體系中加入構(gòu)建的重組質(zhì)粒，24℃條件下表達(dá)24小時(shí)，收集表達(dá)產(chǎn)物，用

7、SDS-PAGE和Western blot分析重組蛋白表達(dá)量及其抗原性。
　　結(jié)果應(yīng)用經(jīng)典2D Western blot等免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分別從日本血吸蟲雄蟲和雌蟲可溶性蛋白質(zhì)中篩選出24個(gè)和17個(gè)抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)，用MALDI-TOF/TOF成功鑒定19個(gè)雄蟲抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中2個(gè)蛋白質(zhì)是功能未知的SJCHGC06614異構(gòu)體，另2個(gè)蛋白質(zhì)是鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白β-2異構(gòu)體。成功鑒定13個(gè)雌蟲抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中3個(gè)蛋白質(zhì)是二硫鍵

8、異構(gòu)酶3前體的異構(gòu)體，2個(gè)蛋白質(zhì)是尿苷二磷酸-半乳糖-4-異構(gòu)酶的異構(gòu)體。
　　以Sepharose、羧基修飾磁珠和氨基修飾磁珠為固相載體的直接免疫捕捉法分別獲得3條、5條、6條陽(yáng)性反應(yīng)條帶，在SDS-PAGE膠上找到0條、1條、3條相應(yīng)的抗原蛋白質(zhì)條帶;SPA-Sepharose間接免疫捕捉法獲得7條陽(yáng)性反應(yīng)條帶，在染色膠上相應(yīng)有6條蛋白質(zhì)條帶;免疫共沉淀富集的抗原顯示有11個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)條帶，在染色膠上獲得6條蛋白質(zhì)條帶。

9、　　血吸蟲體被抗原和ER calcistorin蛋白質(zhì)均可通過麥胚無細(xì)胞體系成功表達(dá);Western blot結(jié)果顯示麥胚無細(xì)胞體系表達(dá)的體被抗原蛋白質(zhì)有較好的抗原性，而ER calcistorin未取得預(yù)期抗原性。
　　結(jié)論2-DE、Western blot和生物質(zhì)譜鑒定相結(jié)合是經(jīng)典的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系，具有分辯率高、分離完整的蛋白質(zhì)分子，可發(fā)現(xiàn)未知的全新抗原蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，用于篩選、鑒定血吸蟲成蟲診斷抗原切實(shí)可行，但該技術(shù)體