硬蜱耐藥基因D6的獲得與ReaL-time PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、蜱是一類(lèi)具有頑強(qiáng)生命力并對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的體表寄生蟲(chóng)。是世界第二大生物傳播媒介，能夠傳播多種疾病，可感染動(dòng)物和人類(lèi)。在世界范圍內(nèi)廣泛存在，對(duì)人類(lèi)自身健康、動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和自然環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重危害，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前主要的滅蜱方法有生物防治、化學(xué)藥物防治、植物源防治、人工防治等，最普遍最主要的防治方法是化學(xué)藥物防治。長(zhǎng)期的化學(xué)藥物使用，使蜱的某些基因發(fā)生突變而導(dǎo)致耐藥性，并且化學(xué)藥物的殘留對(duì)自然環(huán)境和人畜的危害也在不斷地加重。為了能夠快速

2、、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)出蜱的耐藥性，避免化學(xué)藥物的濫用和減少因化學(xué)藥物造成的蜱耐藥性引起的經(jīng)濟(jì)損失，指導(dǎo)臨床合理用藥，本實(shí)驗(yàn)探索建立了快速檢測(cè)蜱耐藥性基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。主要研究的內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的微小牛蜱的陽(yáng)性基因組克隆，構(gòu)建普通PCR方法所需要的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。通過(guò)序列比對(duì)設(shè)計(jì)出普通PCR檢測(cè)方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法所需要的引物和探針。并提取300份來(lái)自湖南、甘肅等地的血紅扇頭蜱、青海

3、血蜱、長(zhǎng)角血蜱的基因組作為待測(cè)樣品。篩選特異性引物和探針，并與普通PCR方法進(jìn)行敏感性比對(duì)。
　　2、構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量PCR的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，成功建立蜱鈉通道耐藥性基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法。對(duì)定量PCR的反應(yīng)條件和體系進(jìn)行不斷優(yōu)化，得到較好的擴(kuò)增效率和線(xiàn)性相關(guān)性。并與感染梨形蟲(chóng)的蜱基因組進(jìn)行特異性試驗(yàn)，顯示此方法的特異性較好。陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果與普通PCR相比，其敏感性是普通PCR的1000倍，表明此方法的敏感性

4、較好。并使用不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示組內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)Ct值均小于5％，組間的變異系數(shù)均小于10％,表明此方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性較好。
　　3、使用本實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)來(lái)自湖南芷江血紅扇頭蜱、甘肅臨潭青海血蜱、甘肅永靖長(zhǎng)角血蜱的300份基因組進(jìn)行檢測(cè)。按照TaqMan探針?lè)ǖ年?yáng)性標(biāo)準(zhǔn)在300份樣品中共檢測(cè)到263份樣品含有鈉通道耐藥性基因，陽(yáng)性率為87.67％。蜱種內(nèi)

5、的陽(yáng)性分布分別為湖南芷江微小牛蜱的陽(yáng)性率為8734％(69/79)，湖南芷江血紅扇頭蜱的陽(yáng)性率為8750％(63/72)，甘肅臨潭青海血蜱的陽(yáng)性率為92.31％(60/65)，甘肅永靖長(zhǎng)角血蜱的陽(yáng)性率為8452％(71/81)。使用普通PCR檢測(cè)出來(lái)的陽(yáng)性率為47.0％，使用本實(shí)驗(yàn)所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)出來(lái)的陽(yáng)性率為8767％陽(yáng)性符合率為100％。普通PCR檢測(cè)為陰性的樣品中有110份使用熒光定量PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，從而證