Aurora B靶向性抑制劑的篩選及小分子化合物S2的藥學價值探討.pdf

1、有絲分裂過程中,通過染色體的分離,母細胞平均分配自己的遺傳物質(zhì)至子細胞,使子細胞得到完全相同的遺傳物質(zhì)。忠實的染色體分離和胞漿運動是保證兩個子細胞得到完全相同的遺傳物質(zhì)的前提條件,上述過程的缺陷容易引起非整倍體或多倍體。Aurora是保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族之一,在染色體的分離和胞質(zhì)運動中有非常重要的作用。Aurora家族的三個成員(AuroraA/B/C)在細胞有絲分裂的調(diào)控中起到重要的作用。根據(jù)眾多研究成果顯示,針對Aurora

2、設計的小分子抑制劑能夠有效的抑制腫瘤,是藥物研發(fā)的一個熱點。
　　 首先,我們成功的建立了有效的高通量篩選模型。采用這個高通量篩選模型,我們對國家新藥篩選中心庫藏的70,000個小分子化合物進行了高通量篩選,得到了近1000個一級陽性化合物,進而從一級陽性化合物中篩選出數(shù)十個二級陽性化合物。通過對所有實驗組的檢驗,該模型的各項參數(shù)都達到了高通量篩選模型構(gòu)建的標準。
　　 通過Biacore3000檢測,我們驗證了陽性化合

3、物與Aurora激酶的相互作用并計算結(jié)合動力曲線,證實陽性化合物與目標靶點有很強的結(jié)合能力。對化合物的激酶特異性進行檢測,證實在參與測試的二十種激酶中,陽性化合物對Aurora激酶的抑制強度全部排在首位,對其他激酶大多沒有非特異性抑制。
　　 為了進一步驗證陽性化合物是否能夠在細胞水平上對腫瘤細胞系的生長和增殖起到抑制作用,我們針對化合物的后期驗證建立了專門的細胞模型。在國家重點實驗室細胞庫的支持下,我們對陽性化合物作用于近二十

4、種細胞系的IC50進行了驗證。實驗證明,通過化合物培養(yǎng)基摻入處理96h,包括肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、宮頸癌、胰腺癌等多種組織來源在內(nèi)的細胞系顯示出不同程度的生長抑制。而在去除化合物后,部分細胞系恢復正常生長,另一部分細胞系無法恢復正常的快速生長狀態(tài)。
　　 通過對多種細胞系的時間梯度和藥物濃度梯度生長曲線進行檢測,我們測定了化合物的細胞生長抑制IC50曲線。通過化合物摻入處理,肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、宮頸癌、胰腺癌等

5、多種組織來源的細胞系增殖均受到了較大程度的抑制。克隆形成率試驗證明,化合物處理的腫瘤細胞單克隆的形成能力大大下降。通過westernblotting,immunofluorescence等方法,檢測到內(nèi)源性HistoneH3(Ser10)的磷酸化水平大幅下降,通過驗證化合物在細胞水平對AuroraB激酶活性的抑制,初步探明了化合物抑制腫瘤細胞增殖的分子機理。流式細胞儀檢測顯示,化合物處理的細胞出現(xiàn)顯著的G2/M期阻斷。
　　 為

6、驗證化合物在體內(nèi)對腫瘤生長的抑制作用,我們建立了化合物體內(nèi)作用檢測的動物模型。對于人QGY裸鼠移植瘤模型,化合物于5mg/kg的劑量即顯示明顯的抑瘤效果(p＜0.05)。通過小鼠急性毒理實驗檢測,化合物的半數(shù)致死量為有效劑量近40倍,在小鼠中未見明顯副作用。
　　 長期以來,傳統(tǒng)抗癌藥物大都是屬于細胞毒類藥物。盡管傳統(tǒng)抗癌藥物具有一定的臨床療效,但由于它們無法區(qū)分腫瘤細胞和正常機體細胞,因而會引起嚴重毒副反應。2001年,諾華公

7、司的酪氨酸激酶抑制劑藥物格列衛(wèi)(Gleveec)的上市,標志著激酶抑制劑類藥物正式獲得認可。2006年,多靶點藥物多吉美(Sorafenib)的上市,更顯示出了多靶點靶向性治療藥物的發(fā)展趨勢。多吉美一方面通過抑制RAF/MEK/ERK信號傳導通路直接抑制腫瘤生長,另一方面通過抑制VEGFR和PDGFR阻止為腫瘤提供營養(yǎng)的新生血管生成,通過雙重作用機理而達到治療效果。靶向性藥物可以針對攜帶有特異性靶標的癌癥細胞,同時具有較少的毒副反應,因

8、此,靶向抗癌藥物已經(jīng)逐漸開始成為腫瘤治療領域里的骨干力量。近幾年來,針對Aurora.的小分子激酶抑制劑藥物開發(fā)得到了國際科研界和醫(yī)藥工業(yè)界的高度重視,出現(xiàn)了如ZM447439,Hesperadin,VX-680,AZD1152,PHA-680632等進入臨床研究階段的小分子抑制劑。因此,我們針對AuroraB的小分子抑制劑篩選及藥學研究,以期為具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的小分子新藥研發(fā)提供新的線索。
　　 另外,我們還就人類甘油磷酸

9、化二酯酶(Glycerophosphodiesterphosphodiesterase,GDPD)基因的克隆和主要功能進行了初步研究。我們從人類睪丸cDNA文庫中擴增GDPD5的全長序列。根據(jù)生物信息學分析,該基因在UCSC基因組數(shù)據(jù)庫中定位在11q13.4-q13.5。通過免疫熒光實驗,我們檢測了GDPD5在亞細胞結(jié)構(gòu)的定位情況,并以RT-PCR的方法分析GDPD5基因在人類各種組織中的表達。在此基礎上,通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)對GDP