1、重組蓖麻毒素A鏈蛋白的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性的測(cè)定2、芋螺毒素MⅦA基因的融合表達(dá)及其鎮(zhèn)痛活性的測(cè)定.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文1、重組蓖麻毒素A鏈蛋白的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性的測(cè)定2、芋螺毒素MⅦA基因的融合表達(dá)及其鎮(zhèn)痛活性的測(cè)定姓名：陳永對(duì)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：詹金彪20040501浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 陳永對(duì)與同樣經(jīng)E c o RI 和H i n dI I I 雙酶切的p K K 2 2 3 _ 3 載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒p K K 2 2 3 ．3 一R T A —K D E L 。把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸

2、桿菌J M l 0 9 中，挑取轉(zhuǎn)化成功的單克隆菌，接種到含A m p 的L B 培養(yǎng)基中，于3 T C 振搖過夜。以2 ％比例接種入新鮮M 9 培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，加入I P T G 至終濃度為l m M ，在溫度為3 0℃的條件下誘導(dǎo)表達(dá)3 小時(shí)。為了摸索出蛋白表達(dá)時(shí)的最佳條件，首先分別在不同的溫度下( 2 2 ℃、3 0 “ C 、3 7 “ C ) 誘導(dǎo)表達(dá)相同的時(shí)間，以得到最適表達(dá)溫度。然后在最適表達(dá)溫度下，誘導(dǎo)表達(dá)不同的

3、時(shí)間( 1 小時(shí)、3 小時(shí)、5 小時(shí)) ，以摸索出蛋白表達(dá)的最佳時(shí)間。表達(dá)出的蛋白經(jīng)超聲破碎后，取其上清。上清液過B l u e —S e p h a r o s e6 B 柱，進(jìn)行一步親和層析，得到純化的R T A 和R T A —K D E L 重組蛋白。以此兩種蛋白與不同的細(xì)胞株( H e l a 細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞M C F 一7 、人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞E C V - 3 0 4 細(xì)胞) 進(jìn)行共培養(yǎng)，采用M T T 法測(cè)定它們對(duì)不同

4、的細(xì)胞株的殺傷作用。通過本實(shí)驗(yàn)，可以得到以下結(jié)論：( 1 ) 、以P C R 方法，成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒p K K 2 2 3 ．3 ．R T A ．K D E L 。( 2 ) 、經(jīng)I P T G 誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)化子E ．c o l iB L 2 1( p K K 2 2 3 ．3 ．R T A - K D E L ) d P 出現(xiàn)了一條分子量約為3 1 ，0 0 0 大小的條帶，與預(yù)期的蛋白質(zhì)分子量相符。而作為對(duì)照的未誘導(dǎo)菌液中則沒有此

5、分子量的濃帶。( 3 ) 、通過對(duì)蛋白表達(dá)時(shí)的最佳條件的摸索可知，在3 0 “ C 、誘導(dǎo)表達(dá)5 小時(shí)時(shí)，細(xì)菌產(chǎn)生的可溶性R T A 蛋白較多，而R T A - K D E L 蛋白則在3 0 “ C 、誘導(dǎo)表達(dá)3 小時(shí)的條件下，可溶性較好。( 4 ) 、通過誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，經(jīng)過B l u e ．S e p h a r o s e 6 B一步親和純化，S D S ．P A G E 檢查看出，只有一條分子量約為3 10 0 0 大小