炎癥狀態(tài)下GR對豬TLR2、4表達的調控.pdf

1、天然免疫，作為機體抵抗病原入侵的第一道防線，可在病原感染之初迅速調動機體防御系統(tǒng)。天然免疫這種強大功能的激活，主要依靠Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)對病原進行識別，繼而激活補體系統(tǒng)，誘導細胞因子、化學增活素等天然免疫效應分子的分泌，調動NK細胞和吞噬細胞，從而對病原進行應答。病原入侵也可激活HPA軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)對天然免疫進行調控。糖皮質激素受體（

2、Glucocorticoid receptor，GR）作為應激反應的效應器，可以對TLR信號通路進行調控。許多研究表明，GR可以在轉錄水平上以“蛋白-基因”、“蛋白-蛋白”等模式，對TLR所介導的信號分子進行轉錄調控從而抑制炎癥反應。盡管如此，GR作為轉錄因子，直接對TLR進行轉錄調控的研究較少。
　　眾所周知，病原感染以及疫苗免疫會激發(fā)機體對病原產(chǎn)生特異性免疫反應。盡管如此，豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumo

3、niae）感染后GR是否直接對豬肺臟TLR2進行轉錄調控，以及疫苗免疫是否對此產(chǎn)生干擾作用，目前還不清楚。另一方面，現(xiàn)代養(yǎng)殖場的很多管理方式都會誘使家畜產(chǎn)生應激。許多研究采用ACTH長時間處理動物來模擬慢性應激反應，而使用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）處理動物可模擬病原菌感染所誘導的急性炎性反應。ACTH預處理所模擬的慢性應激，是否會通過影響TLRs/GR的交互作用干擾LPS在豬組織局部誘導炎癥反應，目前尚不清楚

4、。
　　本課題在豬肺炎支原體感染動物模型以及LPS誘導的炎癥反應動物模型中，研究了GR對TLR2/4的轉錄調控機制，以及疫苗免疫或ACTH預處理對這種轉錄調控的影響。本論文分為三大主要部分。
　　1.豬肺炎支原體感染狀態(tài)下豬肺臟GR對TLR2的調控以及疫苗免疫的影響
　　本試驗從5窩豬群（約克×梅山）中選取15頭15d仔豬（每窩3頭），并將其隨機分為三組，分別為對照組(CC);未免疫感染組(NI);免疫感染組豬(VI)

5、。VI組豬通過頸部肌肉注射1 mL豬肺炎支原體疫苗，其它兩組豬（CC和NI組）以相同的方式模擬注射等量PBS。一個月后，VI和NI組豬經(jīng)氣管注射2 mL攻毒株(109CCU/mL)，而CC豬以相同的方式模擬注射等量PBS。研究結果顯示，NI組豬出現(xiàn)支原體感染的典型肺炎病理損傷，肺損傷評分顯著高于VI組（P＜0.05），疫苗免疫可以顯著緩解豬肺炎支原體感染引起的臨床癥狀以及肉眼可見的肺臟損傷，而對照組沒有出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和肺臟病理變化。

6、盡管如此，NI和VI組豬肺臟支原體DNA的含量分別為104.14 copies/mL和103.67 copies/mL，均極顯著高于對照組（P＜0.01），疫苗免疫沒有改變肺臟豬肺炎支原體DNA含量。NI組以及VI組豬血清皮質醇水平分別為52.2 ng/mL和33.8 ng/mL，均極顯著低于CC組（CC組為76.8 ng/mL;P＜0.01），但只有VI組GR在核內的表達顯著低于CC組（P＜0.05）。TLRs1～10均在豬肺臟中有表

7、達，其中TLR2的表達量最高。NI組豬TLR2 mRNA的表達上調(P＜0.05)，而VI組無明顯的變化。使用染色質免疫共沉淀技術，發(fā)現(xiàn)NI組豬GR與TLR2啟動子的結合上調（P＜0.05），但VI組豬呈下調趨勢。這表明豬肺炎支原體疫苗免疫，可能通過抑制GR核轉移以及GR與TLR2啟動子的結合，從而抑制肺TLR2的基因轉錄。
　　2.LPS處理狀態(tài)下GR對豬肺臟TLR表達的調控以及慢性應激的影響
　　24頭三元雜交（杜洛克×

8、長白×大白）雄性仔豬，平均體重為12±0.5 kg，隨機分為4個處理組，每組6頭豬，分別為空白對照組(CC);無ACTH預處理的LPS注射組(LPS);ACTH單獨注射組(ACTH);有ACTH預處理的LPS注射組(ACTH+LPS)。ACTH以及ACTH+LPS組豬連續(xù)兩天肌肉注射ACTH（2.25 IU/kg體重），每隔6小時注射一次，共注射7次，其余兩組在相同時間點等體積注射生理鹽水。最后一次ACTH注射后6h，向LPS組以及AC

9、TH+LPS組豬肌肉注射LPS（15μg/kg體重），其余兩組以相同方式注射等體積生理鹽水。研究結果發(fā)現(xiàn)，無ACTH預處理時LPS顯著上調了血清腫瘤壞死因子（TNF）-α以及肺臟IL-1β mRNA、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達水平(P＜0.05)，但對肺臟白細胞介素(IL)-6、TNF-α以及環(huán)氧合酶(COX)-2mRNA的表達無顯著影響;ACTH預處理對LPS所誘導的肺臟炎癥因子的表達無顯著影響;ACTH單獨處理對這些促炎因

10、子的表達無顯著影響。無ACTH預處理時LPS顯著下調了肺臟皮質醇水平（P＜0.05）;ACTH預處理對LPS的處理效果無顯著作用;與對照組相比，ACTH單獨處理引起皮質醇的水平下調（P＜0.05）。無ACTH預處理時LPS顯著上調了TLR2 mRNA表達(P＜0.05);ACTH預處理對LPS的處理效果無顯著影響。無ACTH預處理時LPS有下調總GR表達的趨勢(P=0.089);ACTH預處理對LPS的處理效果無顯著作用;與對照組相比，

11、ACTH單獨處理也可顯著下調GR總蛋白的表達(P=0.041)。LPS處理未影響GR對TLR2、4基因啟動子的結合，ACTH對此無顯著作用。這些結果說明，LPS可能通過激活TLR2基因轉錄，以及抑制GC以及總GR蛋白的表達，從而引起肺臟發(fā)生輕微的炎癥反應，在此過程中，LPS并沒有影響GR與TLR2啟動子的結合。ACTH預處理所模擬的慢性應激對LPS在肺臟的促炎作用無顯著影響。
　　3.LPS處理狀態(tài)下GR對豬腎上腺TLR表達的調控

12、以及慢性應激的影響
　　腎上腺幫助機體維持最佳的生理和免疫功能，它不僅是機體應激系統(tǒng)的終末器官，還具有在急、慢性應激反應時調節(jié)機體免疫系統(tǒng)的功能，從而提高宿主對病原入侵的抵抗能力。鑒于腎上腺在機體抵御應激反應中的重要性，本試驗繼續(xù)探討ACTH處理是否會通過TLRs/GR的交互作用，干擾LPS在腎上腺刺激的炎癥反應。本試驗的動物處理同上述第二部分試驗。LPS單獨刺激可使腎上腺細胞線粒體亞結構發(fā)生代償性損傷，ACTH預處理可以明顯緩解

13、LPS對線粒體的損傷。無ACTH預處理時，LPS可引起IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、COX-2 mRNA表達的上調（P＜0.05）;ACTH預處理對LPS的誘導效果無顯著作用。無ACTH預處理時，LPS有上調IL-6蛋白表達的趨勢(P=0.065);有ACTH預處理時，可顯著抑制LPS的誘導作用(P＜0.05)，下調IL-6蛋白的表達。無ACTH預處理時，LPS處理2h會極顯著上調血清皮質醇水平(P＜0.01);ACTH

14、預處理會顯著緩解LPS的作用，使LPS處理6h后腎上腺以及血清中的皮質醇恢復到基礎水平。無ACTH預處理時，LPS處理可顯著下調T-SOD活性（P＜0.05）;ACTH預處理對LPS的處理效果無顯著作用。LPS處理僅對iNOS活性存在主效應，具有顯著的上調作用(P=0.048)。LPS處理分別極顯著和顯著地促進TLR2和TLR4 mRNA的表達（P＜0.01或P＜0.05），但對TLR2、TLR4蛋白的表達卻無顯著作用;ACTH預處理對

15、LPS的處理效果有顯著影響，可顯著下調TLR2mRNA的表達（P＜0.05），并有下調TLR4 mRNA表達的趨勢(P=0.067)。在無ACTH預處理時，LPS處理會使腎上腺GR mRNA表達顯著上調（P＜0.05）;ACTH預處理，對LPS的處理效果無顯著作用。LPS極顯著降低以TLR4基因為靶的ssc-miR-338表達（P＜0.01），但對ssc-miR-146b表達無顯著影響;與對照組相比，ACTH預處理可與LPS共同促進ss

16、c-miR-146b表達上調(P＜0.05)。LPS可顯著降低GR對TLR4基因啟動子GRE的結合(P＜0.05)。單純ACTH處理，對炎癥因子的釋放，皮質醇水平，氧化應激反應，TLR2、TLR4以及GR基因的轉錄，ssc-miR-146b表達都無顯著影響。這說明，LPS可能通過抑制GR與TLR4啟動子的結合，從而直接激活TLR4基因的轉錄，促進腎上腺細胞因子的釋放，進而刺激皮質醇的分泌。ACTH預處理后，TLR2、TLR4基因的轉錄水