丁苯酞、卡馬西平對(duì)大鼠海馬、小腦神經(jīng)元凋亡及認(rèn)知功能影響的研究.pdf

1、目的:
　　卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)又稱酰胺咪嗪，與三環(huán)類抗抑郁藥結(jié)構(gòu)相似，通過阻斷電壓依賴性鈉離子通道，減少突觸前谷氨酸(Glu)釋放和細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，增加腦內(nèi)5-羥色胺(5-HT)水平，從而降低神經(jīng)元興奮性。CBZ作為一線抗癲癇藥物(antiepileptic drugs，AEDS)，因其價(jià)格低廉，療效顯著，臨床應(yīng)用非常廣泛。但AEDS療程長(zhǎng)、依從性差且個(gè)體間不良反應(yīng)差異大、副作用多，癥

2、狀表現(xiàn)各異，可累及多個(gè)器官及系統(tǒng)。
　　丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide，NBP)在改善腦缺血、促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)方面有明顯效果，近期研究證明，NBP不僅從形態(tài)和功能上對(duì)線粒體發(fā)揮保護(hù)作用，還可以降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分率，并能上調(diào)大鼠缺血腦組織中的BDNF的表達(dá)，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。
　　為排除癲癇發(fā)作本身對(duì)認(rèn)知功能及凋亡的損害，了解CBZ對(duì)認(rèn)知損傷的差異性，本實(shí)驗(yàn)以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，通過觀察CBZ及NBP對(duì)

3、大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及認(rèn)知的影響，探討CBZ對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)毒副作用以及NBP抑制凋亡、改善認(rèn)知的作用機(jī)制，為更好地指導(dǎo)臨床用藥、減少藥物不良反應(yīng)提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:7周齡健康雄性成熟SD(Sprague-Dawley)大鼠（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）36只，實(shí)驗(yàn)起始體重150～190g;自然晝夜，22～25℃環(huán)境喂養(yǎng)，每籠6只，換氣扇通風(fēng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。隨

4、機(jī)分為YY組（NS+花生油），NBP組(NBP+花生油+NS組)，C1組(CBZ低劑量+NS+花生油組)，C2組（CBZ高劑量+NS+花生油），NC1組(CBZ低劑量+NS+NBP+花生油)，NC2組（CBZ高劑量+NS+NBP+花生油），每組6只。按人與大鼠給藥劑量的換算公式（以公斤體重計(jì)算，大鼠的劑量為人用藥劑量的6.25倍），具體為低劑量CBZ125mg/kg/d，NBP80mg/kg/d，高劑量CBZ采取LD50的1/8，具體劑

5、量為高劑量CBZ500mg/kg/d，一天一次灌胃器灌胃30天。
　　2灌注及取材:10％的水合氯醛麻醉后仰臥固定，剪開胸骨，暴露心臟，灌注針經(jīng)心尖部入左心室經(jīng)主動(dòng)脈瓣入升主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心耳放血，先快速注入生理鹽水，以止血鉗夾固灌注針，右心耳流出無色液體后，用4％的多聚甲醛固定，待灌注成功后立即斷頭取材，放入4％的多聚甲醛固定液中進(jìn)行固定24小時(shí)。標(biāo)本經(jīng)過脫水、透明、石蠟包埋及切片，供HE、尼氏染色、免疫組化測(cè)定使用。另外每組

6、隨機(jī)選取2只大鼠麻醉后用1％多聚甲醛-1.25％戊二醛0.1M磷酸緩沖液灌流固定后，取大鼠海馬區(qū)域的腦組織標(biāo)本，經(jīng)透射電子顯微鏡觀察海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元及小腦浦肯野細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
　　3凋亡及認(rèn)知指標(biāo)測(cè)定:大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及小腦皮質(zhì)浦肯野細(xì)胞蠟切片經(jīng)HE染色光鏡下觀察大鼠腦組織的形態(tài)學(xué)變化，尼氏染色觀察尼氏小體的變化，水迷宮觀察大鼠認(rèn)知行為學(xué)的變化，免疫組化染色法觀察凋亡相關(guān)基因Bax及Bcl-2的表達(dá)情況和認(rèn)知相關(guān)基因B

7、DNF的表達(dá)情況。
　　4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。多組間均數(shù)顯著性檢驗(yàn)應(yīng)用One-Way ANOVA，其中方差齊性資料采用SNK檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩組間比較;非齊性資料用Tamhane'S T2檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有顯著性。
　　結(jié)果:
　　1 HE染色結(jié)果
　　1.1海馬CA1及CA3區(qū):各組腦組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞密集，排列整齊。偶見細(xì)胞皺縮，與周圍細(xì)胞分離，嗜酸性染色增強(qiáng)，細(xì)胞核

8、、染色質(zhì)聚集成團(tuán)塊狀，與YY組相比，無明顯形態(tài)學(xué)改變。
　　1.2小腦浦肯野細(xì)胞:各組可見浦肯野細(xì)胞密集，排列整齊，偶見細(xì)胞體積縮小，與YY組相比，無明顯形態(tài)學(xué)差異。
　　2尼氏染色結(jié)果
　　2.1海馬CA1及CA3區(qū):各組海馬錐體細(xì)胞密度大且排列規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)染色清晰，呈均勻一致的紫藍(lán)色，胞漿中可見尼式小體，神經(jīng)元未見異常形態(tài)改變。
　　2.2小腦浦肯野細(xì)胞:Nissl染色能顯示浦肯野細(xì)胞胞體及與連接胞體的主樹突

9、，胞質(zhì)中可見成斑塊狀堆積的藍(lán)紫色尼體小體，胞核及其核仁清晰可見，神經(jīng)元未見異常形態(tài)改變。
　　3免疫組化染色法檢測(cè)Bax、Bcl-2及BDNF表達(dá)結(jié)果
　　3.1 Bax表達(dá)結(jié)果
　　3.1.1海馬CA1區(qū):CBZ組可見Bax表達(dá)陽性細(xì)胞明顯增多，胞漿呈棕黃色，染色較深。YY組和NBP組可見Bax表達(dá)陽性細(xì)胞稀疏、散在分布，且染色淺淡。通過采用Image Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定Bax表達(dá)陽性細(xì)胞的平均光

10、密度值（OD值），C1組與C2組相比Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，該兩組的Bax表達(dá)比其余四組均增高，與其余四組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); NC1組與NC2組相比Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，該兩組與C1組與C2組相比的Bax表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與YY組與NBP組相比Bax表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　3.1.2海馬CA3區(qū):各組均可見少量、散在

11、分布的Bax表達(dá)陽性細(xì)胞，測(cè)定Bax表達(dá)陽性細(xì)胞的OD值，C1組與C2組相比Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，該兩組的Bax表達(dá)比其余四組均增高，與其余四組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); NC1組與NC2組相比Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），該兩組與C1組及C2組相比的Bax表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與YY組及NBP組相比Bax表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　3.

12、1.3小腦浦肯野細(xì)胞區(qū):NC1組與NC2組相比Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，該兩組與C1組及C2組相比Bax表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與YY組及NBP組相比Bax表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);NBP組比YY組Bax表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.2 Bcl-2表達(dá)結(jié)果
　　3.2.1海馬CA1區(qū):C1組和C2組Bel-2表達(dá)陽性細(xì)胞顯著增多，胞質(zhì)呈棕黃色或

13、褐色，染色較深。NBP組和YY組Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞稀疏、散在分布，細(xì)胞著色淺淡。CBZ+NBP組Bel-2表達(dá)陽性細(xì)胞著色較CBZ組明顯稍淺。通過采用Image Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞的平均光密度值（OD值），各組之間相比存在差異，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.2.2海馬CA3區(qū):各組均可見Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞廣泛分布，胞質(zhì)深染呈棕黃色或褐色，測(cè)定Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞的

14、OD值，各組之間Bcl-2表達(dá)存在差異但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.2.3小腦浦肯野細(xì)胞區(qū):各組之間Bcl-2表達(dá)存在差異但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3.3 BDNF表達(dá)結(jié)果
　　3.3.1海馬CA1區(qū):在放大400倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，BDNF免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞主要集中在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細(xì)胞，表現(xiàn)為整個(gè)細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色，各組均可見BDNF表達(dá)，表達(dá)量較高，各組OD值相比，但差異均

15、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3.3.2海馬CA3區(qū):各組均可見BDNF表達(dá)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3.3.3小腦浦肯野細(xì)胞區(qū):BDNF在海馬表達(dá)的最多，浦肯野細(xì)胞的BDNF表達(dá)明顯減少。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出:各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4水迷宮結(jié)果
　　4.1水迷宮逃避潛伏期結(jié)果:從訓(xùn)練的第2天開始，六組大鼠逃避潛伏期均有下降的趨勢(shì)，說明訓(xùn)練可以增強(qiáng)學(xué)

16、習(xí)記憶能力，各組大鼠通過4天的訓(xùn)練，建立了空間記憶(p＜0.01)，但各組大鼠間學(xué)習(xí)記憶能力無明顯不同（P＞0.05）。
　　4.2水迷宮穿越平臺(tái)次數(shù)結(jié)果:各組之間穿越平臺(tái)次數(shù)的均數(shù)比較存在差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　5透射電鏡觀察結(jié)果
　　5.1海馬CA1區(qū):各組海馬CA1區(qū)細(xì)胞大體結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)異常，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元核膜清晰，核質(zhì)均勻，核膜無內(nèi)陷，胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富，胞質(zhì)內(nèi)可見大量的核糖體，線粒體無腫脹、線粒

17、體嵴無斷裂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池?zé)o擴(kuò)張。
　　5.2小腦浦肯野細(xì)胞區(qū):各組浦肯野細(xì)胞細(xì)胞大體結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)異常。細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元核膜清晰，核質(zhì)均勻，核膜無內(nèi)陷，胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富。
　　結(jié)論:
　　1灌服常規(guī)劑量卡馬西平，對(duì)正常成年SD大鼠海馬及小腦Bax、Bcl-2表達(dá)有影響，對(duì)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)及認(rèn)知功能無明顯改變，說明卡馬西平短期服用對(duì)神經(jīng)元的損害可能是可逆的，且機(jī)體的自身調(diào)節(jié)使凋亡難度增加，可能是一種機(jī)體對(duì)藥物損害的保護(hù)性反應(yīng);