CYP11B1基因新突變致11β-OHD一例家系研究.pdf

1、研究背景:先天性腎上腺增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一組由于控制腎上腺皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮合成的各種酶缺乏導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳疾病。CAH患者根據(jù)不同的酶缺陷而有非常廣泛的臨床表現(xiàn)譜，這些酶包括21-羥化酶，11β-羥化酶，3β-羥類(lèi)固醇脫氫酶，17α-羥化酶等[1]。11β-羥化酶缺陷癥(11β-hydroxylase deficiency，11β-OHD)是CAH的第二大原因，占CAH5

2、-8％，在非近親結(jié)婚人群中發(fā)病率約為1:100000-1:200000[2]。11β-OHD根據(jù)臨床癥狀嚴(yán)重程度及酶活性的缺陷程度分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型。典型的11β-OHD引起特征性的皮質(zhì)醇合成減少。皮質(zhì)醇缺乏反饋性增加促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)增加，引起腎上腺皮質(zhì)增生，伴隨類(lèi)固醇前體物質(zhì)增加，從而促進(jìn)雄激素合成通路亢進(jìn)。過(guò)多的腎上腺來(lái)源雄激素導(dǎo)致女性男性化、假兩性畸形、男性假性性早熟。皮質(zhì)酮通路受阻導(dǎo)致11-去氧皮質(zhì)酮(11-Deo

3、xycorticosterone，DOC)及其代謝物積聚，這些物質(zhì)具有鹽皮質(zhì)激素活性，從而導(dǎo)致鈉潴留及容量擴(kuò)張[3]。
　　編碼11β-羥化酶的基因CYP11B1位于8q24.3，包含9個(gè)外顯子。該基因長(zhǎng)5.4kb，功能上與合成醛固酮(ALD)的CYP11B2基因相似。這兩個(gè)基因具有95％的序列同源性，相距約40kb。與21-羥化酶患者中基因型與表型具有良好的相關(guān)性不同，在11β-OHD患者中很難預(yù)測(cè)突變對(duì)酶活性及臨床表型的影響，

4、這與11β-OHD患者數(shù)量較少，難以形成大規(guī)模研究有關(guān)[4]。但是， CYP11B1基因分析可以協(xié)助確診11β-OHD以及有助于遺傳咨詢。
　　研究目的:本研究采集了一例高血壓伴低血鉀患者，明確患者為經(jīng)典型11β-OHD。對(duì)患者及其家系進(jìn)行CYP11B1基因分析，發(fā)現(xiàn)了一種剪接突變。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)明確患者遺傳形式;利用小基因技術(shù)，通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建體外表達(dá)mRNA，明確該剪接突變對(duì)mRNA的影響。
　　研究方法:通過(guò)實(shí)

5、驗(yàn)室及影像學(xué)檢查結(jié)合患者家系資料收集，達(dá)到臨床診斷11β-OHD目的。用EDTA抗凝管留取患者及家系外周血，利用試劑盒提取外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA。根據(jù)基因文庫(kù)中CYP11B1基因序列，利用軟件primer premier6.0設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增各個(gè)外顯子區(qū)域及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)域。分別使用患者及父母DNA為模板擴(kuò)增，目的片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離并純化后，利用ABI3130xl基因測(cè)序儀測(cè)序，并利用Autoassembler2.0軟件將

6、測(cè)序結(jié)果與UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)下載的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，從而找出突變位點(diǎn)。基因測(cè)序結(jié)果顯示患者為純合點(diǎn)突變，母親為雜合點(diǎn)突變，父親未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，因此推測(cè)患者CYP11B1基因存在父源的大段缺失突變。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)引物通過(guò)圍繞基因點(diǎn)突變兩側(cè)擴(kuò)增，產(chǎn)物為150bp，通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)該片段拷貝數(shù)定量。此外，由于該突變?yōu)榧艚油蛔?，為明確突變對(duì)mRNA剪接的影響，我們利用小基因技術(shù)，通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建并導(dǎo)入工程細(xì)胞中來(lái)體外表達(dá)，明確突變對(duì)mRN

7、A剪接的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.臨床診斷:患者臨床確診為經(jīng)典型11β-OHD。患者家系成員中父親、母親、哥哥、姐姐均表型正常。
　　2.患者及家系突變檢測(cè)結(jié)果:(1)Sanger測(cè)序顯示患者CYP11B1基因c.595+1G＞A純合形式突變。該突變?yōu)榧艚油蛔?，?jīng)初步生物信息學(xué)分析(Augustus)明顯影響mRNA剪接?；颊吣赣H、姐姐攜帶c.595+1G＞A雜合突變，父親該位點(diǎn)未見(jiàn)異常。
　　3.熒光實(shí)時(shí)