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文檔簡介
1、目的：探討在流動狀態(tài)下TSP2-8CUB1+2 片段是否影響ADAMTS13 裂解活性。
方法：
⑴以人ADAMTS-13 cDNA 為模板，通過聚合酶鏈反應(PCR)技術擴增缺失TSP2-8CUB1+2的ADAMTS-13 cDNA；并重組于真核表達載體pcDNA3.1-V5-His，構(gòu)建重組質(zhì)粒。
⑵以脂質(zhì)體法將全長和重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細胞，用Western blot法對目的蛋白質(zhì)的表達
2、進行鑒定。
⑶用Western blot 方法檢測對比分析流動狀態(tài)下全長和重組蛋白的活性差異。
結(jié)果：
⑴瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR 擴增出的特異片段約2163bp，DNA 測序結(jié)果與Genebank 報道的完全一致，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒ADAMTS-13(缺失TSP2-8 CUB1+2)-pcDNA3.1/V5-His-TOPO。
⑵收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的COS7細胞培養(yǎng)液，經(jīng)超濾管濃
3、縮后，進行Western blot電泳分析，結(jié)果證實全長和重組蛋白為細胞上清分泌性表達。
⑶在mini vortexer 誘導的剪切力條件下，缺失TSP2-8CUB1+2的ADAMTS13蛋白活性較全長ADAMTS13蛋白活性顯著下降。
結(jié)論：
⑴成功構(gòu)建了缺失TSP2-8CUB1+2的ADAMTS-13重組質(zhì)粒，并表達了全長和重組的ADAMTS13蛋白。
⑵初步證實：在流動狀態(tài)下
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