補體C5a-C5aR通路對缺血再灌注誘發(fā)自噬的影響.pdf

1、急性腎損傷是臨床上一類由多種病因引起的常見綜合征，主要表現(xiàn)為腎功能的急劇下降，氮質(zhì)血癥，并伴有水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂。急性腎損傷發(fā)病率逐年增高，特別是住院病人和重癥病人。目前針對急性腎損傷尚無特異性的治療藥物，雖然輕微的損傷經(jīng)積極干預大多可以逆轉(zhuǎn)，但仍有部分存在持續(xù)性損傷的患者，逐漸發(fā)展為慢性腎臟病，最終需要腎臟替代治療。在眾多的急性腎損傷發(fā)病原因中，缺血再灌注損傷是其重要的原因之一。在腎移植手術中，缺血再灌注也是難以避免的過程，它造成

2、的損傷直接關系到移植物的存活。因此，研究缺血再灌注損傷的分子機制，為尋找新的藥物靶點提供理論依據(jù)。
　　目前的研究表明，炎癥反應在急性腎損傷的發(fā)病中扮演著關鍵角色，缺血再灌注后腎臟局部可見大量的炎癥細胞浸潤，并伴有大量炎癥因子活化。補體系統(tǒng)作為固有免疫的重要組成部分，能活化和加劇炎癥反應，在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，但其具體機制尚不清楚。補體C5作為系統(tǒng)活化后的關鍵分子，在缺血再灌注損傷中更是受到廣泛關注。有研究發(fā)現(xiàn)，補體C5

3、aR基因缺陷能明顯改善缺血再灌注腎損傷，同時，自噬在缺血再灌注中也被大量被活化，因此我們提出假設：在缺血再灌注中，補體C5a/C5aR通過直接或間接的方式促進自噬的產(chǎn)生參與腎損傷的發(fā)生。在此假設基礎上，本研究利用小鼠腎臟缺血再灌注誘導急性腎損傷動物模型，采用C5aR基因敲除小鼠和野生型對照小鼠為研究對象，探討補體C5a/C5aR通路對自噬的調(diào)節(jié)作用。
　　目的：
　　探討C5a/C5aR通路對缺血再灌注中自噬的調(diào)節(jié)作用。

4、r>　　方法：
　　1.體內(nèi)實驗
　　1.1.動物模型的建立和實驗設計：選擇6-8周的雄性C5aR基因敲除小鼠和野生型對照小鼠為研究對象。將野生型對照小鼠和C5aR基因缺陷小鼠分為假手術組、缺血再灌注組。通過微動脈夾夾閉小鼠雙側(cè)腎蒂的方法建立小鼠腎臟缺血再灌注損傷動物模型。缺血再灌注組打開腹腔并夾閉雙側(cè)腎蒂35min，假手術組僅打開腹腔，不夾閉腎蒂。
　　1.2.采用免疫組化法檢測各組小鼠腎臟C5aR和自噬相關蛋白LC

5、3和P62的表達。
　　1.3.采用HE染色觀察比較各組小鼠腎臟病理損傷。
　　1.4.采用全自動生化分析儀測定各組小鼠再灌注24h后的血清BUN濃度。
　　1.5.采用RT-PCR測定各組小鼠C5aR和KIM-1的mRNA水平。
　　1.6.采用免疫熒光檢測自噬相關蛋白LC3的表達。
　　1.7.采用western-blot檢測自噬相關蛋白LC3Ⅱ和P62的表達情況。
　　2.體外實驗
　　2

6、.1.體外培養(yǎng)人腎小管上皮細胞系HK2細胞，用不同濃度的重組C5a刺激，采用western-blot檢測自噬相關蛋白LC3Ⅱ的表達。
　　2.2.采用重組C5a或C5a聯(lián)合C5aR拮抗劑(C5aR Antagonist，C5aRA)刺激培養(yǎng)HK2細胞24h，免疫細胞熒光檢測LC3的表達。
　　2.3.采用重組C5a或C5a聯(lián)合C5aRA刺激培養(yǎng)HK2細胞24h，western-blot檢測自噬相關蛋白LC3Ⅱ的表達。

7、　　結(jié)果：
　　1.體內(nèi)實驗
　　1.1.免疫組化和RT-PCR結(jié)果顯示：與假手術組相比，缺血再灌注后補體C5aR的蛋白水平和mRNA水平均顯著增高。
　　1.2.與野生型對照小鼠組相比，C5aR基因敲除小鼠腎臟病理損傷程度明顯減輕，BUN濃度下降，KIM-1的mRNA水平也降低。
　　1.3.缺血再灌注后，野生型小鼠腎組織自噬相關蛋白LC3的表達隨時間延長逐漸升高。
　　1.4.與野生型對照小鼠組相比，C

8、5aR基因敲除小鼠LC3的表達下降，P62表達增高，表明C5aR基因敲除能有效降低缺血再灌注誘發(fā)的自噬。
　　2.體外實驗
　　2.1.western-blot結(jié)果表明：隨著C5a的刺激濃度增高，自噬相關蛋白LC3Ⅱ的表達逐漸增強。
　　2.2.免疫細胞熒光結(jié)果提示：重組C5a能增加LC3的表達，加入C5aRA后，LC3表達顯著下調(diào)。
　　2.3.western-blot結(jié)果顯示：重組C5a能增加LC3Ⅱ的表達，