模板調控下納米礦化骨材料的形成及其對rMSC行為的影響.pdf

1、天然骨是由膠原蛋白為主的有機相和低結晶度的羥基磷灰石為主的無機相構成的復合礦物質，具有精妙的分級組織結構。骨的形成過程，是在自然生物礦化環(huán)境下，通過納米級的HA晶體沿著膠原纖維取向生長，并逐級組裝成為有序、定向成核生長的礦化膠原纖維。這種有機物介導的分子自組裝，能有效控制并調節(jié)生物材料的微觀結構與形貌。近年來，利用蛋白模板誘導礦化和協(xié)同自組裝技術，構建新型納米骨組織醫(yī)用支架是一個新趨勢。隨著近代結晶工程的發(fā)展，根據(jù)生物礦化的原理，已經有

2、多種有機物被廣泛用作于晶體生長調控劑，從而實現(xiàn)對無機物成核、生長和結晶產物尺寸和形貌的可控性合成。
　　目前，基于骨修復材料的自組裝和生物礦化已經有許多研究，很多蛋白質及大分子例如I型膠原、重組膠原、絲素蛋白、海藻酸鹽、牙釉質蛋白1、兩性肽分子等，均被用作模板以介導和調控無機晶體的生長。然而，自然界中的礦化過程不應僅是單一模板介導調控的結果，許多生物分子也參與了這個調控過程，扮演重要角色。
　　因此，本課題設計合成了一種新型

3、的嵌合體復合蛋白模板，它兼具促進和抑制HA晶體成核、生長的特點。首先，將具有誘導HA晶體成核生長的絲素蛋白（SF），經化學反應接入可抑制礦化結晶球形白蛋白（ALB），形成嵌合體復合模板，然后通過單模板和復合模板的選擇，控制誘導合成不同形貌的HA礦化納米顆粒。通過對蛋白模板的Zeta電位和圓二色譜法（CD）表征，可以確定了這種復合模板蛋白的結構。通過分析得出 ALB-SF嵌合模板由于其二級結構和功能結構域的改變，從而影響蛋白質作為模板下的

4、晶體定向成核、生長。隨后，對模板誘導下礦化合成的納米顆粒進行了XRD、FTIR、SEM、TEM、HR-TEM和TGA的表征分析。結果表明仿生礦化合成的無機相主要表現(xiàn)為羥基磷灰石，尺寸處于納米級別，且晶體處于弱結晶性狀態(tài)。SF單模板下誘導合成的HA呈棒狀，沿著蛋白模板C軸方向定向生長；相應的，ALB-SF復合模板下合成的HA成球狀，結晶程度很低，且沿著蛋白模板C軸方向串成鏈珠狀。
　　納米顆粒與細胞間的相容性以及對其行為、功能的影響

5、已被廣泛研究。目前，大多數(shù)相關研究關注的重點都在顆粒的尺寸，以及表面化學基團對體內或體外組織特異性細胞的生物活性影響，而顆粒的納米形貌對細胞行為調控的方向鮮有被關注。同時，仿生礦化形成的不同形貌的羥基磷灰石納米顆粒，還未被用于干細胞行為影響的研究。因此，本課題使用大鼠骨髓間充質干細胞（rMSC）作為納米顆粒形貌影響的研究對象，通過一系列對細胞粘附、遷移、增殖的檢測，比較和分析不同形貌下的礦化納米顆粒對細胞行為的調控。此外，在本研究中還首

6、次將礦化顆粒進行熒光標記，通過共聚焦激光電鏡和透射電鏡觀察顆粒在干細胞表面的聚集情況，以及通過胞吞作用穿過細胞膜進入胞內并參與細胞內化和正常生長代謝途徑的過程和程度，以此深入分析細胞與材料間的相互作用，從而直接反映干細胞對不同形貌的HA納米顆粒的響應。
　　此外，還研究了兩種不同晶體形貌的礦化納米顆粒對 rMSC向成骨方向分化的影響。通過將 rMSC分別與這兩種礦化納米顆粒在分化培養(yǎng)基的誘導下共培養(yǎng)，研究不同形貌的顆粒攝取、內化對

7、成骨誘導能力的影響。從一系列定性和定量的實驗，分析成骨分化早中晚期標志性表達的堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)、骨橋蛋白(OPN)、骨粘素(ONN)、I型膠原(COL I)以及鈣結節(jié)等水平，表明兩種礦化納米顆?？纱龠MrMSC成骨分化形成及體外礦化的產生，且實驗證明ALB-SF/HA組的促進上調趨勢更為明顯。接著，通過動物實驗評估了該礦化納米材料的體內相容性和促骨修復能力。皮下植入實驗的結果表明，材料具有良好的生物相容性和降解性，并