力生長(zhǎng)因子E肽對(duì)體外骨形成與骨吸收的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGFI)是含有70個(gè)氨基酸的單鏈多肽,為骨基質(zhì)中含量最豐富的生長(zhǎng)因子,對(duì)骨代謝有著重要的調(diào)節(jié)作用。IGFI的E結(jié)構(gòu)域發(fā)生選擇性剪接產(chǎn)生3種異構(gòu)體:IGFIEa,IGFIEb(大鼠)和IGFIEc(人類)。其中IGFIEb和IGFIEc一般在肌肉或成骨細(xì)胞受到機(jī)械刺激或損傷時(shí)才得以表達(dá),因此也稱作力生長(zhǎng)因子(mechano-growth factor,MGF)。分子結(jié)構(gòu)表征發(fā)現(xiàn)MGF羧基端E結(jié)構(gòu)域含有24個(gè)氨基酸組成

2、的短肽(也稱MGF-Ct24E),正是由于MGF-Ct24E才導(dǎo)致MGF功能上與IGFI和IGFIEa不同。MGF自1996年被Goldspink研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)以來,許多研究證實(shí)MGF是一種重要的局部組織修復(fù)因子。當(dāng)機(jī)體受到機(jī)械刺激或組織受損后,MGF得以表達(dá)并誘導(dǎo)體內(nèi)衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化。MGF-Ct24E與MGF功能相似,也具有誘導(dǎo)成肌細(xì)胞增殖和神經(jīng)保護(hù)作用,提示 MGF-Ct24E一旦從MGF分離出來,其本身固有的生物活性如組織保護(hù)、

3、修復(fù)和適應(yīng)等將得以發(fā)揮。我們前期研究發(fā)現(xiàn)MGF以自分泌或旁分泌的方式積極響應(yīng)骨細(xì)胞(或組織)損傷修復(fù),在兔骨折模型中MGF-Ct24E通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和血管新生加速骨折愈合?；诒菊n題組對(duì)MGF-Ct24E的前期研究成果,本研究試圖從細(xì)胞水平和分子水平探索MGF-Ct24E對(duì)骨形成與骨吸收的影響,以便于尋求確切的靶基因和信息通路,為其將來臨床應(yīng)用于骨修復(fù)提供可能。主要研究?jī)?nèi)容包括
　　㈠MGF-Ct24E對(duì)成骨細(xì)胞的功能調(diào)控及

4、轉(zhuǎn)錄組分析：①通過檢測(cè)MGF-Ct24E對(duì)新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖、周期、分化及礦化的影響,結(jié)果表明MGF-Ct24E促進(jìn)早期成骨細(xì)胞增殖延遲終末分化,促進(jìn)晚期成骨細(xì)胞分化和礦化,最終促進(jìn)骨形成。②利用基因芯片檢測(cè)MGF-Ct24E對(duì)成骨細(xì)胞骨形成過程中基因表達(dá)的影響,結(jié)果表明 MGF-Ct24E能有效調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞基因的表達(dá),差異表達(dá)基因總共2054個(gè),其中上調(diào)1179個(gè),下調(diào)基因875個(gè);qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,所選擇的12個(gè)差異表達(dá)基

5、因(IL1RN、FIGF、CXCL12、ZW10、NOTHCH2、TWIST2、ALPL、IGFBF5、FGFR2、COMP、COL2A1和 IGFI)的差異表達(dá)情況與基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致,驗(yàn)證了基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。③應(yīng)用GoSurfer軟件和在線軟件DAVID對(duì)MGF-Ct24E調(diào)控成骨細(xì)胞差異表達(dá)的基因進(jìn)行 GO分析,發(fā)現(xiàn)富集指數(shù)最高的差異表達(dá)基因定位于細(xì)胞內(nèi)部、具有酶結(jié)合功能、參與細(xì)胞周期進(jìn)程。Pathway分析發(fā)現(xiàn)這些

6、差異表達(dá)基因主要參與調(diào)控粘著斑通路、細(xì)胞周期通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控通路、縫隙連接通路、MAPK信號(hào)通路、黏著連接通路和胰島素信號(hào)通路等67個(gè)信號(hào)通路。④對(duì)差異表達(dá)基因GO生物學(xué)過程第3~8層次的節(jié)點(diǎn)和Term進(jìn)行仔細(xì)篩選,總共得到95個(gè)成骨細(xì)胞相關(guān)基因。GO生物學(xué)過程分析發(fā)現(xiàn),這些基因主要富集的功能分類包括成細(xì)胞周期、骨細(xì)胞分化負(fù)調(diào)控、骨化負(fù)調(diào)控、軟骨骨化、骨化調(diào)控、骨發(fā)育、骨化、骨礦化、血管生成、成骨細(xì)胞分化、骨骼系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞正

7、在調(diào)控、細(xì)胞增殖、創(chuàng)傷反應(yīng)等。Pathway分析發(fā)現(xiàn)它們主要參與調(diào)控黏著斑、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體作用通路、細(xì)胞因子及其受體的相互作用通路、MAPK信號(hào)通路、黏著連接通路、TGF-β信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路等多9個(gè)通路。
　?、鍹GF-Ct24E對(duì)破骨細(xì)胞的功能調(diào)控及轉(zhuǎn)錄組分析：①通過檢測(cè)MGF-Ct24E對(duì)破骨細(xì)胞增殖、周期、分化以及骨吸收功能的影響,結(jié)果顯示:MGF-Ct24E不僅抑

8、制破骨前體細(xì)胞的增殖,還抑制破骨細(xì)胞的形成和分化,且具有濃度依賴性;此外,MGF-Ct24E對(duì)破骨細(xì)胞的骨吸收功能也存在較為顯著的抑制作用。②利用基因芯片檢測(cè)MGF-Ct24E對(duì)破骨細(xì)胞分化過程中基因表達(dá)的調(diào)控,結(jié)果表明MGF-Ct24E能有效調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞基因的表達(dá),差異表達(dá)基因總共1712個(gè),其中上調(diào)717個(gè),下調(diào)895個(gè);qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示所選擇的8差異表達(dá)基因(AKT2、SPP1、NF1、ITGB5、NFATc1、TRAF6、M

9、MP9和 CTSK)的差異表達(dá)情況與基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致,驗(yàn)證了基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。③應(yīng)用GoSurfer軟件和在線軟件DAVID對(duì)MGF-Ct24E調(diào)控破骨細(xì)胞差異表達(dá)的基因進(jìn)行 GO分析,結(jié)果顯示富集指數(shù)最高的基因定位于細(xì)胞內(nèi)部、具有核苷酸結(jié)合功能、參與細(xì)胞周期進(jìn)程。Pathway分析發(fā)現(xiàn)MGF-Ct24E調(diào)控的差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、錯(cuò)配修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、同源重組、堿基切除修復(fù)、嘧啶代謝、TGF-β

10、信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、硫酸乙酰肝素生物合成、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、戊糖磷酸途徑、谷胱甘肽代謝通路、Wnt信號(hào)通路、嘌呤代謝通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等20個(gè)信號(hào)通路。④對(duì)差異表達(dá)基因GO生物學(xué)過程第3~8層次的節(jié)點(diǎn)和Term進(jìn)行仔細(xì)篩選,得到79個(gè)與破骨細(xì)胞密切相關(guān)聯(lián)的差異表達(dá)基因,進(jìn)一步生物學(xué)過程GO分析發(fā)現(xiàn),上調(diào)基因主要富集的功能包括細(xì)胞分化,器官發(fā)育,骨骼發(fā)育,