MicroRNA-126對INS-1細胞功能的調控作用.pdf

1、研究背景：
　　糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種常見的內分泌代謝性疾病。其基本病理特點為胰島素分泌絕對或相對不足，或外周組織對胰島素不敏感，以糖代謝紊亂為主，包括脂肪、蛋白質代謝紊亂的一種全身性疾病。糖尿病的患病率在全球逐年增長。據世界衛(wèi)生組織WHO估計,至2030年,全球糖尿病患病人數將達3億。據估計，中國現有成人糖尿病患者9240萬，已成為世界糖尿病人數最多的國家。在糖尿病患者中90％以上是Ⅱ型糖尿病，

2、嚴重影響人們的健康。糖尿病發(fā)病機理較為復雜，而胰島素抵抗在Ⅱ型糖尿病的發(fā)生過程中扮演重要角色，但胰島素抵抗的機制尚不明確。
　　胰島素是一種蛋白質類激素，由體內胰島β細胞分泌，體內唯一降血糖激素。胰島素信號通路涉及多個環(huán)節(jié)，其中鈣離子濃度的變化對胰島素的分泌有重要影響。有文獻報道，在胰島素信號通路中存在著microRNA(miRNA,miR)-126的作用靶點，且本實驗室前期工作證實胰島素受體底物1（IRS-1）也是其作用靶點。但

3、是miR-126是否影響胰島β細胞合成和釋放胰島素尚不明確。本課題利用胰島瘤B細胞（INS-1）模型，研究miR-126對INS-1細胞電壓敏感鈣通道電流、鈣離子濃度及胰島素分泌量的影響。
　　實驗方法：
　　1.鋪種INS-1細胞，24h后轉染40nM的不同miRNA,轉染時間為48h，人工合成胰島素100nM刺激細胞12h。熒光定量PCR檢測INS-1細胞中miR-126基因的表達水平。
　　2.激光共聚焦技術檢測

4、INS-1細胞內鈣離子濃度變化，分組：①陰性對照組（NC）組，轉染nonsense strand；②miR-126過表達（miR-126m）組，轉染miR-126 mimic；③miR-126低表達（miR-126i）組，轉染miR-126 inhibitor；④陽性對照（miR-375m）組，轉染miR-375 mimic。
　　3.穿孔膜片鉗技術檢測INS-1細胞膜上電壓敏感鈣通道電流，分組：陰性對照（NC）組和miR-126

5、m組。
　　4. Elisa實驗和流式細胞儀，分別檢測INS-1細胞胰島素分泌量及線粒體膜電位變化，分組：陰性對照（NC）組，miR-126m組，miR-126i組，陽性對照（miR-375m）組。
　　實驗結果：
　　1.熒光定量PCR結果顯示：與NC組基因miR-126（107.26±37.88，n=4）的表達量相比，miR-126m組（398.77±53.72，n=4）的基因表達量顯著升高（P<0.01）；而mi

6、R-126i組（20.26±7.827，n=4）的基因表達量較NC組的明顯下降（P<0.05）。
　　2.激光共聚焦技術檢測INS-1細胞內鈣離子濃度，結果顯示：基礎葡萄糖（5.6mM葡萄糖）刺激細胞，miR-126m組細胞內鈣離子濃度較NC組明顯升高（P<0.05），miR-126i組細胞內鈣離子濃度較NC組顯著降低（P<0.05）；高濃度葡萄糖（16.8mM葡萄糖）刺激細胞，miR-126m組細胞內鈣離子濃度和NC組無顯著差異

7、（P>0.05）；miR-126i組細胞內鈣離子濃度較NC組顯著降低（P<0.05）。穿孔膜片鉗技術檢測細胞膜電壓敏感鈣通道電流，結果顯示：與NC組相比，miR-126m組細胞鈣離子內流增加（P<0.05）。
　　3. Elisa實驗檢測胰島素分泌量，結果顯示：基礎胰島素分泌量miR-126m組較NC組分泌量增加（P<0.05）；miR-126i組胰島素分泌量較NC組顯著降低（P<0.05）；高濃度葡萄糖刺激細胞，其胰島素分泌量：

8、miR-126m組胰島素分泌量和NC組無顯著差異（P>0.05）；miR-126i組胰島素分泌量較NC組顯著降低（P<0.05）。流式細胞儀檢測線粒體膜電位，結果顯示：與NC組相比，miR-126m組和miR-375m組細胞凋亡增加（P<0.05），miR-126i組細胞凋亡降低（P<0.05）。
　　實驗結論：
　　1.過表達miR-126可以增加INS-1細胞內鈣離子濃度，并且使鈣離子內流增加；
　　2.過表達mi