波動性高糖下血紅素加氧酶-1對INS-1細(xì)胞保護(hù)作用的研究.pdf

1、[背景]
　　 目前,全球范圍內(nèi)糖尿病的患病率正迅速增長。糖尿病已成為繼心血管病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病。糖尿病及其并發(fā)癥可引起多系統(tǒng)損害,具有較高的致殘率和致死率,嚴(yán)重威脅人類健康,并給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,糖尿病的防治已經(jīng)成為日趨重要的公共衛(wèi)生學(xué)問題,而該問題的解決有賴于對糖尿病的病因及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入探討。一般認(rèn)為,胰島β細(xì)胞功能障礙是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,對其相關(guān)機(jī)制加強(qiáng)研究具有重要意義。<

2、br>　　 研究表明,胰島β細(xì)胞凋亡增加所致的β細(xì)胞數(shù)量減少是引起胰島功能障礙的重要機(jī)制之一。因此,β細(xì)胞凋亡可能在糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。在眾多誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的因素當(dāng)中,高血糖受到了普遍關(guān)注。大量研究表明,穩(wěn)定性高糖可促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡的增加。而在胰島β細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控中,Bcl-2基因家族可能起著重要的作用。在穩(wěn)定性高糖干預(yù)下,胰島β細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因Bax表達(dá)顯著增加,而抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)則明顯下降,提示Bc

3、l-2/Bax的表達(dá)變化可能參與高糖介導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡的調(diào)控。近年來發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡之間關(guān)系密切。有研究提示高糖可通過引起顯著的氧化應(yīng)激加重血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。多項體內(nèi)外研究亦表明,氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡,經(jīng)抗氧化處理后可抑制凋亡,下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)并促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)。因此,穩(wěn)定性高糖可通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激促進(jìn)β細(xì)胞凋亡的增加,并下調(diào)胞內(nèi)Bcl-2/Bax表達(dá)比值。
　　 研究提示,上調(diào)HO-1的表達(dá)具有

4、拮抗氧化應(yīng)激的防御保護(hù)作用,HO-1的這種保護(hù)作用在包括器官移植、缺血再灌注損傷、心腦血管疾病等多個領(lǐng)域已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。既往研究顯示,高糖可促使血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng),而通過上調(diào)HO-1表達(dá)則可有效拮抗高糖所致的氧化應(yīng)激,相反地,下調(diào)HO-1表達(dá)則加劇氧化應(yīng)激。有關(guān)胰島細(xì)胞的研究表明,在穩(wěn)定性高糖干預(yù)下,誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增高可有效降低INS-1細(xì)胞的ROS水平,并改善胰島素分泌功能,提示在高糖條件下,HO-1可能通過拮抗氧化應(yīng)激而發(fā)

5、揮保護(hù)胰島B細(xì)胞功能的作用。目前的研究認(rèn)為,HO-1拮抗氧化應(yīng)激的機(jī)制可能包括以下幾方面:1)自身產(chǎn)物的抗氧化作用；2)降低ROS生成酶的活性；3)誘導(dǎo)其他抗氧化酶的表達(dá)。
　　 上調(diào)HO-1表達(dá)還具有抗凋亡的作用,這在多種細(xì)胞中已得到證實(shí)。研究提示,轉(zhuǎn)染HO-1基因可減輕高糖引起的微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長停滯和凋亡；經(jīng)血晶素和姜黃誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增加可有效抑制血管緊張素Ⅱ引起的大鼠腎近端小管上皮細(xì)胞凋亡,而下調(diào)HO-1表達(dá)后可加重凋

6、亡。HO-1的抗凋亡作用在胰島B細(xì)胞的保護(hù)方面亦成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)HO-1表達(dá)可有效減輕胰島B細(xì)胞株的凋亡水平,并改善移植后胰島功能。目前,HO-1抗凋亡的機(jī)制尚未完全闡明,可能跟以下因素有關(guān):(1)上調(diào)p21的表達(dá)；(2)NF-κB與MAPK信號途徑的參與；(3)調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2。
　　 已有的研究提示,穩(wěn)定性高糖可通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激而誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)增高,那么波動性高糖下胰島β細(xì)胞內(nèi)的Ho-1表達(dá)

7、如何呢?波動性高糖與穩(wěn)定性高糖相比其對胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響是否存在差異?而在波動性高糖下,通過調(diào)控HO-1表達(dá)是否對胰島β細(xì)胞發(fā)揮抗氧化、抗凋亡的保護(hù)作用呢?目前關(guān)于這些方面內(nèi)容的報道較少,有待于進(jìn)一步研究。本課題以胰島素瘤細(xì)胞株INS-1作為β細(xì)胞研究模型,觀察波動性高糖下HO-1表達(dá)、ROS產(chǎn)量及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax的表達(dá)變化,并在調(diào)控HO-1表達(dá)后研究上述指標(biāo)的變化,探討波動性高糖下HO-1對胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用及可

8、能機(jī)制,為β細(xì)胞保護(hù)的研究提供新思路。
　　 第一章 波動性高糖下HO-1對INS-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　 [目的]
　　 1.觀察波動性高糖下INS-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的變化。
　　 2.探討波動性高糖下HO-1對INS-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。
　　 [研究對象和方法]
　　 1.以大鼠胰島β細(xì)胞瘤株INS-1細(xì)胞為研究對象,采用含10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37

9、℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。
　　 2.實(shí)驗分為5組:
　　 (1)正常對照組(Ctrl組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為5.5mmol/L的RPMI1640完全培養(yǎng)基中):
　　 (2)穩(wěn)定性高糖組(CHG組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為16.7mmol/L的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)；
　　 (3)波動性高糖組(FHG組,細(xì)胞在葡萄糖濃度為16.7mmol/L的RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時后更換為葡萄糖

10、濃度為5.5mmol/L的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3小時,如此重復(fù)交替3次,夜間9小時維持在葡萄糖濃度為5.5mmol/L的RPMI1640完全培養(yǎng)基中):
　　 (4)鈷原卟啉(CoPP,20 μmol/L)+波動性高糖組(CoPP+FHG組,細(xì)胞經(jīng)HO-1誘導(dǎo)劑CoPP預(yù)處理24小時后再進(jìn)行葡萄糖濃度的波動)；
　　 (5)鋅原卟啉(ZnPP,20 μmol/L)+波動性高糖組(ZnPP+FHG組,細(xì)胞經(jīng)HO-

11、1抑制劑ZnPP預(yù)處理24小時后再進(jìn)行葡萄糖濃度的波動)。
　　 以上各組正式干預(yù)前均采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時,以保持各組細(xì)胞同步化生長；各組均干預(yù)72小時。
　　 3.免疫印跡法(Western blot)檢測HO-1蛋白表達(dá):提取細(xì)胞總蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,脫脂牛奶封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn),兔抗多克隆HO-1抗體(一抗)4℃孵育過夜,充分沖洗后,辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG

12、(二抗)常溫下孵育1小時,最后發(fā)光、顯影及定影,以Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白條帶灰度值,將HO-1蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白灰度值的比值作為HO-1蛋白相對表達(dá)量。
　　 4.細(xì)胞ROS產(chǎn)量的檢測:以DCFH-DA為熒光探針,在488nm激發(fā)波長,525nm發(fā)射波長的設(shè)置下,流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ROS平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)。實(shí)驗中設(shè)立不添加探針的陰

13、性對照組。
　　 5.四氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測各組細(xì)胞活力:各組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后,分別經(jīng)MTT、二甲亞砜處理后,酶標(biāo)儀檢測各孔490nm處的光吸收值(OD值)。結(jié)果以正常對照組OD值標(biāo)化余各組OD值,即設(shè)定正常對照組細(xì)胞活力為100％,由此計算余各組細(xì)胞活力百分比。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,多組資料比較采用單向方差分析(One-way ANO

14、VA),進(jìn)一步多重比較采用LSD法(Least-significant difference test)。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [結(jié)論]
　　 1.穩(wěn)定性高糖組、波動性高糖組ROS產(chǎn)量及HO-1蛋白表達(dá)均較正常對照組顯著增高,且波動性高糖組顯著高于穩(wěn)定性高糖組；而細(xì)胞活力則均顯著降低,以波動性高糖組最低,提示:高糖對INS-1細(xì)胞產(chǎn)生顯著的氧化應(yīng)激；與穩(wěn)定性高糖相比,波動性高糖可能產(chǎn)生更嚴(yán)重的氧化

15、應(yīng)激,從而對細(xì)胞造成更大的損害。
　　 2.在波動性高糖環(huán)境下,INS-1細(xì)胞內(nèi)HO-1蛋白的代償性表達(dá)增高并不能有效拮抗氧化應(yīng)激而發(fā)揮保護(hù)作用。
　　 3.誘導(dǎo)H0-1表達(dá)增高可顯著降低ROS產(chǎn)量,并提升細(xì)胞活力,提示HO-1的誘導(dǎo)性表達(dá)增高可有效拮抗INS-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激,發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用；相反地,抑制H0-1表達(dá)則加重氧化應(yīng)激,導(dǎo)致明顯細(xì)胞損害。因此,HO-1可能是INS-1細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化因子之一。

16、　　 第二章 波動性高糖下HO-1對INS-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響
　　 [目的]
　　 通過調(diào)節(jié)HO-1的表達(dá)后觀察凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)變化,初步探討波動性高糖下Ho-1對INS-1細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　 [研究對象和方法]
　　 1.研究對象和實(shí)驗分組同第一章。
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2在INS-1細(xì)胞中的表達(dá)。顯微鏡下

17、觀察,淺黃色至深棕黃色部分為陽性反應(yīng),主要位于胞漿或胞膜,每張玻片隨機(jī)選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野,使用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件測量每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度值,用OD值表示,以O(shè)D值大小反映蛋白相對表達(dá)量及強(qiáng)度。
　　 3.統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理,各指標(biāo)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,若方差齊性,各組均數(shù)比較采用單向方差分析(One-wayANOVA),若方差不齊

18、,采用Welch法近似方差分析；組內(nèi)多重比較采用LSD法,方差不齊時采用Tamhane’s T2法。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [結(jié)論]
　　 1.與正常對照組相比,波動性高糖組、穩(wěn)定性高糖組促凋亡蛋白Bax表達(dá)均顯著增高,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)均顯著降低,提示高糖可能通過上調(diào)Bax并抑制Bcl-2表達(dá)促進(jìn)INS-1細(xì)胞凋亡。
　　 2.在波動性高糖下,誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增高可能通過促進(jìn)Bcl-