血紅素加氧酶-1在糖尿病氧化應激中的作用研究.pdf

1、糖尿病在全球尤其是發(fā)展中國家的患病人數急劇增加，已成為嚴重危害人類健康的流行性疾病。由于糖尿病慢性并發(fā)癥可引起失明、尿毒癥、截肢等嚴重后果，已成為目前全世界共同關注的公共衛(wèi)生問題，也是目前的防治重點和難點。目前對HO-1在糖尿病氧化應激中的作用及其機制尚未完全闡明，本課題擬從體內外實驗兩方面對HO-1在拮抗糖尿病氧化應激中的作用進行探討，為尋求有效的拮抗糖尿病氧化應激的手段提供科學的依據。 第一章、 HO-1在高糖和AGEs致T

2、HP-1細胞氧化應激中的表達變化研究 目的： 1．探討不同濃度葡萄糖、晚期糖基化終產物（AGEs）在不同刺激時間對THP-1細胞ROS產量的影響； 2．了解高糖和AGEs聯合刺激對THP-1細胞氧化應激的影響； 3．了解HO-1在高糖和AGEs所致THP-1細胞氧化應激中的表達變化； 4．探討p38MAPK信號通路是否參與了高糖和AGEs誘導的THP-1細胞HO-1表達。 方法：

3、1．細胞培養(yǎng)：采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內傳代培養(yǎng)人單核細胞株THP-1。 2．體外制備AGEs：將牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）與葡萄糖混合于37℃孵育60天，4℃透析24h以去除未結合的葡萄糖。 3．細胞ROS產量檢測：分別用5、15、25mmol/L的GLU或25、50、100μg/mL的AGEs刺激細胞，分別于刺激0．5、2、6、24

4、h后收集細胞，DCFH-DA熒光探針標記，流式細胞儀檢測平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）。 4．細胞分組：分為4組，即15mmol/LGLU組（高糖組）、100μg/mLAGEs組（AGEs組）、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs組（高糖+AGEs聯合組）及對照組。 5．細胞培養(yǎng)液上清TNFa水平檢測：采用ELISA方法進行。 6．細胞培養(yǎng)液上清中MDA

5、水平檢測：采用硫代巴比妥酸法（thiobarbituric acid，TBA），嚴格按照試劑盒說明步驟檢測。 7．RT-PCR法檢測HO-1mRNA表達：提取總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），兩步法進行RT-PCR，擴增產物于1．5%瓊脂糖凝膠進行電泳。 8．免疫印記（western blot，WB）法檢測HO-1蛋白表達：提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl

6、sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），電轉移至硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter，NC）封閉非特異位點。利用多克隆兔抗人HO-1抗體及HRP標記的二抗與NC反應，DAB顯色后拍照分析條帶亮度。 9．SB203580（SB，p38MAPK抑制劑）干預實驗：分為高糖組、SB+15mmol/LGLU（SB+高糖）組、AGEs組、SB+100μg/

7、mLAGEs（SB+AGEs）組。10μmo/LSB干預30min后換以含15mmol/LGLU或100μg/mL AGEs細胞培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24h，收集細胞進行RT-PCR檢測HO-1mRNA表達水平。 10．統計學處理：用SPSS13．0軟件對所有數據進行統計學處理；實驗數據計量資料以均數±標準差（x±s）表示。多組間資料比較用析因設計的方差分析（ANOVA），任意兩組間比較采用獨立樣本的t檢驗，相關分析采用積矩相關系數（P

8、earson相關系數）分析，檢驗標準為α=0．05。 結論： 1．高糖和AGEs單獨刺激能導致THP-1細胞氧化損傷加劇、分泌炎癥因子TNFα水平及HO-1表達增高，二者聯合刺激能使上述改變進一步加劇。 2．p38MAPK抑制劑對高糖和AGEs誘導的THP-1細胞HO-1mRNA表達無顯著影響。 3．HO-1表達與細胞氧化損傷及炎癥指標呈顯著正相關，提示高糖和AGEs導致THP-1細胞氧化損傷及炎癥反應，

9、后者誘導HO-1表達適應性和代償性增高，從而發(fā)揮細胞保護作用。 第二章、抑制HO-1對高糖和AGEs致THP-1細胞氧化應激的影響 目的： 探討抑制HO-1表達對高糖和AGEs刺激下THP-1細胞氧化應激的影響。 方法： 1．細胞分組：分為4組，即對照組、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs（GLU+AGEs）組、ZnPP組及ZnPP+15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs（

10、ZnPP+GLU+AGEs）組，其中對照組和ZnPP組THP-1細胞培養(yǎng)液的GLU濃度均為5mmol/L。 2．細胞ROS產量、細胞培養(yǎng)液上清中MDA及TNFa水平、HO-1mRNA及蛋白表達水平檢測同第一章。 3．統計學處理：用SPSS13．0軟件對所有數據進行統計學處理。實驗數據計量資料以均數±標準差（x±s）表示。多組間資料比較用析因設計的方差分析（ANOVA），任意兩組間比較采用獨立樣本的t檢驗，檢驗標準為α=0

11、．05。 結論： HO-1抑制劑ZnPP本身也能對THP-1細胞造成一定的氧化損傷，并引起HO-1表達增高，ZnPP預處理能顯著抑制高糖和AGEs引起的HO-1表達增高，進一步加劇高糖和AGEs引起的細胞氧化損傷及分泌炎癥因子TNFa的水平。 第三章、誘導HO-1對高糖和AGEs致THP-1細胞氧化應激的影響 目的： 探討誘導HO-1高表達是否可對抗高糖和AGEs所致THP-1細胞的氧化損傷。

12、 方法： 1．細胞分組：分為4組，即對照組、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs（GLU+AGEs組）、CoPP組、CoPP+15mmol/LGLU+100μg/mL AGEs（CoPP+GLU+AGEs組），其中對照組和CoPP組THP-1細胞培養(yǎng)液的GLU濃度均為5mmol/L。 2．細胞ROS產量、細胞培養(yǎng)液上清中MDA及TNFa水平、HO-1mRNA及蛋白表達水平檢測同第一章。 3．統計

13、學處理：用SPSS13．0軟件對所有數據進行統計學處理；實驗數據計量資料以均數±標準差（x±s）表示。多組間資料比較用析因設計的方差分析（ANOVA），各組內均數比較采用獨立樣本的t檢驗或單向方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用LSD法（Least-significant difference test）。檢驗標準為α=0．05。 結論： 在高糖和AGEs存在的情況下，HO-1誘導劑CoPP誘導HO-1蛋

14、白表達增加，并顯著抑制細胞氧化應激，明顯減輕高糖和AGEs所致氧化損傷，而CoPP本身并不引起THP-1細胞氧化損傷和分泌炎癥因子水平增加，結果提示誘導HO-1高表達可能是極具潛力的新的糖尿病慢性并發(fā)癥的治療靶點之 第四章、2型糖尿病合并慢性并發(fā)癥患者的外周血單核細胞HO-1表達與氧化應激的相關性研究 目的： 1．了解初診2型糖尿病（type2 diabetes mellitus，T2DM）合并慢性并發(fā)癥患者外周

15、血單核細胞HO-1的表達情況； 2．探討初診T2DM合并慢性并發(fā)癥患者外周血單核細胞HO-1表達與氧化應激的相關性。 方法： 1．樣本選擇：來自我院內分泌代謝科門診及住院的初次診斷T2DM的患者36例，健康志愿者10例。分為正常對照組、糖尿病無并發(fā)癥組和糖尿病并發(fā)癥組。 2．細胞收集：采集清晨空腹靜脈抗凝血，Percoll法分離單核細胞。 3．細胞ROS產量、血清MDA水平及HO-1mRNA表達檢

16、測同第一章。 4．HO-1蛋白表達檢測：采用免疫熒光法檢測，將外周血單核細胞進行免疫熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察HO-1在細胞內的表達情況。 5．統計學處理：用SPSS13．0軟件對所有數據進行統計學處理；實驗數據計量資料以均數±標準差（x±s）表示。兩組間資料比較用獨立樣本的t檢驗，相關分析采用積矩相關系數（Pearson相關系數）分析，檢驗標準為α=0．05。 結論： 1．初診T2DM患者的血糖、血

17、清MDA、外周血單核細胞ROS產量及HO-1表達均顯著高于正常對照組，提示初診T2DM可能由于機體抗氧化防御機制的代償性增高仍不足以對抗高血糖引起的氧化損傷，導致機體處于氧化應激狀態(tài)。 2．并發(fā)癥組的血糖水平、氧化應激指標及HO-1表達均顯著高于無并發(fā)癥組，提示高血糖及其引起的氧化損傷可能參與了初診T2DM患者慢性并發(fā)癥的發(fā)病機制，在排除BMI及血糖水平等因素的影響后，氧化應激指標仍與HO-1表達呈顯著正相關，提示HO-1作為一