T細(xì)胞來源Exosomes調(diào)節(jié)妊娠丟失孕鼠母胎界面CTLA-4FoxP3表達(dá)的研究.pdf

1、目的:正常妊娠的發(fā)生和維持有賴于母體對胚胎半同種抗原的免疫耐受，一旦該狀態(tài)被打破將導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的反復(fù)性妊娠丟失患者中，約50％并無明確臨床病因，稱為不明原因反復(fù)自然妊娠丟失(URSA)。研究妊娠過程中母胎免疫耐受形成的確切機(jī)制，誘導(dǎo)母胎免疫耐受的形成是治療URSA的關(guān)鍵。
　　目前國內(nèi)外多采用丈夫或第三方淋巴細(xì)胞對患者進(jìn)行主動(dòng)免疫治療，但是細(xì)胞需新鮮制備，且穩(wěn)定性差、不易保存，具有明顯局限性，不利于臨床推

2、廣。本研究采用自發(fā)性流產(chǎn)動(dòng)物模型，通過過繼轉(zhuǎn)輸淋巴細(xì)胞及其來源Exosomes，分析T細(xì)胞來源Exosomes調(diào)節(jié)妊娠丟失孕鼠母胎界面CTLA-4及FoxP3表達(dá)的變化，探究Exosomes誘導(dǎo)母胎免疫耐受機(jī)制。
　　方法:
　　1雄性無關(guān)個(gè)體脾細(xì)胞及其Exosomes的制備:摘眼球放血后斷頸處死BALB/c雄鼠，無菌條件下解剖取脾組織，制備脾單個(gè)細(xì)胞懸液，采用蔗糖密度梯度離心聯(lián)合超濾技術(shù)制取脾臟T細(xì)胞來源Exosomes。

3、
　　2建立妊娠丟失實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及實(shí)驗(yàn)分組:雌雄小鼠隨機(jī)按2∶1合籠交配;以CBA/J(♀)×BALB/c（♂）為正常妊娠對照組(Control組)，以CBA/J(♀)×DBA/2(♂)建立妊娠丟失動(dòng)物模型。將流產(chǎn)孕鼠隨機(jī)分為3組分別為:妊娠丟失組（URSA組，孕第4日著床期尾靜脈注射生理鹽水），細(xì)胞治療組（Cellular Therapy組，孕第4日著床期尾靜脈注射雄鼠脾細(xì)胞），非細(xì)胞治療組(Non-cellular Thera

4、py組，孕第4日著床期尾靜脈注射Exsomes)。
　　3各組胚胎發(fā)育情況的觀察:于妊娠第14日處死各組CBA/J孕鼠，無菌條件下解剖，取胎盤組織，測量胎盤各徑線計(jì)算胎盤體積，分別計(jì)數(shù)各組胚胎吸收及存活個(gè)數(shù)，計(jì)算各組胚胎吸收率及妊娠丟失率。
　　4孕鼠母胎界面CTLA-4、FoxP3的免疫組化檢測:制備孕鼠胎盤織石蠟包埋切片，免疫組化染色后進(jìn)行圖像分析，CTLA-4、FoxP3表達(dá)強(qiáng)度以灰度值(GS)表示，數(shù)值大小與陽性表達(dá)

5、強(qiáng)度呈反相關(guān);以矩形走形計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算各組陽性細(xì)胞表達(dá)百分率。
　　5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:各組數(shù)據(jù)均通過SPSS13.0版本軟件進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)。采用卡方檢驗(yàn)比較各組孕鼠胚胎發(fā)育情況，采用F檢驗(yàn)對孕鼠胎盤CTLA-4以及FoxP3的表達(dá)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，S-N-K法進(jìn)一步對多個(gè)樣本均數(shù)進(jìn)行兩兩比較。
　　結(jié)果:
　　1不同過繼轉(zhuǎn)輸對妊娠丟失孕鼠胚胎發(fā)育的影響
　　Control組孕鼠的胚胎

6、吸收率為5.78％，URSA組顯著升高至21.17％(P＜0.0005)，細(xì)胞治療組、非細(xì)胞治療組分別為6.93％、3.25％。與URSA組相比，細(xì)胞治療組及非細(xì)胞治療組胚胎吸收率均顯著下降(均P＜0.01)，并且均下降至Control組水平（均P＞0.05）;非細(xì)胞治療組胚胎吸收率顯著低于細(xì)胞治療組(P＜0.05）。
　　Control組孕鼠的妊娠丟失率為20％，URSA組顯著升高至64％(P＜0.0005)，細(xì)胞治療組、非細(xì)胞

7、治療組分別為24％、16％。與URSA組相比，細(xì)胞治療組及非細(xì)胞治療組妊娠丟失率均顯著下降(均P＜0.01)，且均下降至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　2妊娠丟失孕鼠母胎界面CTLA-4、FoxP3表達(dá)變化的分析
　　2.1母胎界面CTLA-4表達(dá)變化的分析
　　Control組孕鼠胎盤組織中CTLA-4陽性細(xì)胞百分率為31.60％±2.41％，URSA組顯著下

8、降至24.80％±2.86％(P＜0.01)，細(xì)胞治療以及非細(xì)胞治療后陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯回升(分別為34.80％±1.92％、40.40％±5.94％，均P＜0.05)至Control組水平;且非細(xì)胞治療組回升更明顯，兩治療組組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　與正常對照組孕鼠胎盤組織中CTLA-4表達(dá)GS值118.78±10.97相比，妊娠丟失組(URSA組)的表達(dá)GS值115.34±11.02，細(xì)胞治療組及非細(xì)胞治療組

9、陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度分別為127.24±4.08、125.98±6.93;四組之間的組間比較均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.2母胎界面FoxP3表達(dá)變化的分析
　　control組孕鼠胎盤組織中FoxP3陽性細(xì)胞百分率為32.40％±4.50％， URSA陽性細(xì)胞百分率顯著下降至23.4％±2.61％(P＜0.01)，細(xì)胞治療以及非細(xì)胞治療后陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯回升(分別為30.00％±3.39％、45.80％±7.

10、16％，均P＜0.05)至Control組水平;且兩治療組組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　與正常對照組孕鼠胎盤組織中FoxP3表達(dá)強(qiáng)度(116.05±2.48)相比，妊娠丟失組(URSA組)的表達(dá)強(qiáng)度115.59±3.64，差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);細(xì)胞治療組及非細(xì)胞治療組陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度分別為115.47±3.44，110.17±4.19;經(jīng)非細(xì)胞治療后表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，但兩治療組之間及與control組、U