anti-CTLA-4mAb在荷鼠T細(xì)胞淋巴瘤EL-4細(xì)胞裸鼠中作用的實驗研究.pdf

1、目的：現(xiàn)代多種研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程中．抗原特異性T細(xì)胞的激活需要兩種信號，既需要T細(xì)胞上抗原受體(TCR)CD3復(fù)合體接受抗原提呈細(xì)胞提呈的抗原特異性信息（第一信號）外，還同時需要多種輔助因子提供的共刺激信號（costimulatory signal）（第二信號）的參與，否則可導(dǎo)致抗原特異性無應(yīng)答狀態(tài)即免疫耐受，T細(xì)胞處于克隆無能(anergy)狀態(tài)，甚至出現(xiàn)T細(xì)胞的凋亡。CTLA-4是Cytotoxic T Lymp

2、hocytic Associated antigen-4的英文縮寫，指的是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4，又叫CD152，屬于CD28家族成員，與CD28分子在基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、序列的同源性及基因表達(dá)具有十分相近的關(guān)系，都是共刺激分子B7的受體，主要表達(dá)于被激活的CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞。CTLA-4在活化T細(xì)胞膜上的表達(dá)量很少，僅為CD28的1/30～1/50，但其與B7的親和力卻是CD28與B7親和力的20倍以上；作為淋巴細(xì)胞

3、激活的共刺激信號，CTLA-4與CD28分子的功能是相反的。CTLA-4與B7結(jié)合后能抑制小鼠和人T細(xì)胞的激活，在T細(xì)胞活化中起負(fù)調(diào)節(jié)作用，是目前已知的最重要的抑制性粘附分子、免疫性受體之一[1]，是共刺激信號系統(tǒng)中重要的一個負(fù)調(diào)節(jié)因子?？扇苄訡TLA-4單克隆抗體(anti-CTLA-4mAb)可阻止CTLA-4與其天然配體結(jié)合，封閉CTLA-4對T細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)信號的傳導(dǎo)，有效刺激T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)白介素-2的產(chǎn)生，增強(qiáng)T細(xì)胞對各種抗原

4、的反應(yīng)性，可激活機(jī)體免疫反應(yīng)?？扇苄訡TLA-4單克隆抗體，已有研究顯示其能有效的抑制移植物抗宿主反應(yīng)，并已在支氣管哮喘、自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲狀腺疾病等自身免疫性疾病方面進(jìn)行了較多研究探討，針對于惡性淋巴瘤方面的研究較少。
　　 惡性淋巴瘤(Malignant lymphoma，ML)是淋巴結(jié)和結(jié)外部位淋巴組織的免疫細(xì)胞腫瘤，來源于淋巴細(xì)胞或組織細(xì)胞的惡變，包含不同臨床表現(xiàn)和分子生物學(xué)特征的腫瘤。雖然在我國惡性淋巴

5、瘤相對少見，但近年來新發(fā)病例逐年上升，每年至少超過25000例，死亡率為1.5/10萬，占所有惡性腫瘤死亡位數(shù)的第11～13位，與白血病相仿。隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對ML有了更深刻的認(rèn)識，認(rèn)為其發(fā)病可能與病毒（EB病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等）、細(xì)菌感染（如幽門螺桿菌等）、免疫缺損、某些自身免疫性疾病、電離輻射、遺傳因素等有關(guān)，確切機(jī)制迄今尚未完全闡明。目前我們以手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療、免疫治療以及基因靶向治療等治療惡性淋巴瘤，

6、但未能達(dá)到根治程度。進(jìn)行惡性淋巴瘤靶向治療的研究是必要的。
　　 本研究通過觀察CTLA-4單克隆抗體（anti-CTLA-4mAb）對荷瘤鼠T細(xì)胞淋巴瘤EL-4細(xì)胞裸鼠中的作用，研究在惡性淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡中CTLA-4單克隆抗體的作用機(jī)制，希望能為惡性淋巴瘤的靶向治療提供更多的科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.培養(yǎng)鼠T細(xì)胞淋巴瘤EL-4細(xì)胞株，并將其傳代用含有新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(濃度為1

7、0％)培養(yǎng)鼠T細(xì)胞淋巴瘤EL-4細(xì)胞，將淋巴瘤EL-4細(xì)胞置于5％CO2飽和濕度、室溫37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于2～3天后進(jìn)行EL-4細(xì)胞換液傳代。
　　 2.建立實驗所需的荷鼠淋巴瘤EL-4細(xì)胞株裸鼠模型用4Gy劑量的鈷60照射5周齡左右的Balb/c裸鼠，3天后于裸鼠右腋皮下接種EL-4細(xì)胞，劑量為0.2mL/只，相當(dāng)于每1mL含3×107個EL-4細(xì)胞左右。待接種的瘤塊增長至所需2～3cm后，處死荷瘤裸鼠。在無菌條件下將

8、腫瘤瘤塊分割成均勻的、小塊，大小約2～3mm左右；隨后分別注入10只Balb/c裸鼠（5周齡左右）頭背部皮下。10天后，發(fā)現(xiàn)瘤塊長勢良好。隨機(jī)分為2組，每組5只，分別為實驗組、對照組，在腫瘤瘤塊體積長至100mm3左右時開始給藥anti-CTLA-4mAb。
　　 3.荷鼠淋巴瘤EL-4細(xì)胞株裸鼠腹腔給藥anti-CTLA-4mAb將anti-CTLA-4mAb稀釋至濃度為10g/L，每只裸鼠腹腔內(nèi)注射0.2ml（約2mg），共

9、用anti-CTLA-4mAb治療2天。
　　 4.測量藥物治療后腫瘤細(xì)胞變化用anti-CTLA-4mAb治療后，測量腫瘤體積變化，測量頻率為每3～4天一次（2次/周），檢測4周時間。
　　 5.處死實驗組、對照組裸鼠用anti-CTLA-4mAb治療后4周，處死所有10只裸鼠，剖取腫瘤組織，將每只裸鼠的腫瘤組織分為5部分；并分別取血約1mL加入EDTA-K2抗凝。
　　 6.觀察用藥前后腫瘤細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)變化

10、將裸鼠的腫瘤組織依次進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟、制蠟塊、蠟塊切片、HE染色、封片等步驟，隨后于顯微鏡下觀察對照組與實驗組中各腫瘤組織形態(tài)的變化。
　　 7.檢測用藥后腫瘤組織中CD4+、CD8+T細(xì)胞浸潤情況將裸鼠的腫瘤組織依次行固定、石蠟包埋、切片、SP法染色等。以PBS緩沖液視為陰性對照，若細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色則判定為陽性細(xì)胞（參照試劑說明進(jìn)行陽性結(jié)果判定）。高倍鏡(×200)下隨機(jī)觀察每張組織切片中的5個高倍視野，計數(shù)200個

11、細(xì)胞/每高倍視野，計數(shù)陽性細(xì)胞百分比，將其作為結(jié)果。
　　 8.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測裸鼠外周血中用藥前后的CD4+CD25+Tr細(xì)胞變化情況分別取用0.1mlEDTA-K2抗凝血，分別加入20μL的CD4、CD25抗體，于正常室溫情況下孵育30分鐘后加入紅細(xì)胞裂解液使紅細(xì)胞裂解，并用破膜劑、固定劑處理紅細(xì)胞，其后應(yīng)用Expo32 ADC上機(jī)進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，用Muticycle AV分析對DNA細(xì)胞周期進(jìn)行分析。
　　

12、 9.應(yīng)用RT-PCR檢測EL-4細(xì)胞c-myc、β-catenin、survivin和cyclinD1mRNA四種基因的表達(dá)提取10只裸鼠中每只腫瘤細(xì)胞RNA總數(shù)量，并行RNA純度鑒定以及RNA完整性檢測，行引物（所有RT-PCR引物均由上海生物工程公司合成）設(shè)計，將細(xì)胞總RNA預(yù)溫，后加入逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA;再將PCR擴(kuò)增后取其擴(kuò)增后產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠加樣孔中加樣打孔，進(jìn)行電泳30min，其后再用凝膠成

13、像系統(tǒng)分析并結(jié)果，并拍攝圖象記錄。以Gel-Pro Analyzer3.1分析軟件進(jìn)行分析條帶光亮度，進(jìn)行半定量分析實驗，并計算相對系數(shù)。
　　 10.檢測腫瘤細(xì)胞周期的變化及凋亡情況將裸鼠腫瘤組織制備為單細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀應(yīng)用FCM檢測腫瘤細(xì)胞周期的變化及凋亡。
　　 結(jié)果:
　　 1.實驗組顯示CTLA-4單克隆抗體可以抑制鼠淋巴瘤EL-4細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖變化，并與時間相關(guān)。藥物作用時間越長，實驗組中

14、腫瘤細(xì)胞體積較對照組中的腫瘤細(xì)胞體積增長就越緩慢。
　　 2.高倍鏡下可見實驗組中的腫瘤細(xì)胞較對照組浸潤程度較低，腫瘤細(xì)胞大小中等，核多為圓形，核膜清楚，核分裂相少見；對照組中裸鼠在荷淋巴瘤EL-4細(xì)胞后的腫瘤細(xì)胞呈彌漫浸潤，其大小中等，細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則圓形，細(xì)胞核核膜邊界清楚，胞核分裂象易見。
　　 3.實驗組中裸鼠腫瘤組織中CD4+及CD8+T細(xì)胞的比例降低；免疫組化分析結(jié)果顯示實驗組CD4+T細(xì)胞比例為（20.

15、1±0.9）％，對照組CD4+T細(xì)胞浸潤比例為（53.9±1.1）％，P=0.003;實驗組CD8+T細(xì)胞比例為（14.2±0.8）％，對照組CD8+T細(xì)胞浸潤比例為（26.6±1.0）％，P=0.017；兩組有顯著差異(P＜0.05)。
　　 4.實驗組中裸鼠外周血中CD4+CD25+Tr細(xì)胞的比例降低。實驗組CD4+CD25+Tr細(xì)胞的比例為（1.81±0.89）％，對照組CD4+CD25+Tr細(xì)胞的比例為（5.81±3.6

16、1）％，P=0.006;對照組與實驗組有顯著差異(P＜0.01)。
　　 5.RT-PCR檢測中檢測出鼠淋巴瘤EL-4細(xì)胞擴(kuò)增出與擬擴(kuò)增分子片段大小相符的特異性條帶。實驗組鼠淋巴瘤EL-4細(xì)胞-catenin mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。而實驗組鼠淋巴瘤EL-4細(xì)胞β-catenin/TCF下游靶基因c-myc、Cyclin D1和survivin mRNA表達(dá)水平卻降低了，與對照組

17、相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 6.FCM檢測結(jié)果顯示，實驗組中EL-4細(xì)胞出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，且EL-4細(xì)胞的凋亡率大大增加，實驗組的細(xì)胞凋亡率(15.31％)明顯高于對照組細(xì)胞的凋亡率(3.29％)，P＜0.01；實驗組顯示經(jīng)CTLA-4單克隆抗體作用后腫瘤細(xì)胞中處于G0/G1期細(xì)胞(27.69％)較空白組(17.03％)明顯增加，P=0.011;S期細(xì)胞明顯減少，P=0.004;兩組間差異有顯著性（P＜0.

18、05），CTLA-4單克隆抗體能使細(xì)胞停滯在G0/G1期。
　　 結(jié)論:
　　 1.在應(yīng)用CTLA-4單克隆抗體治療后，CTLA-4單克隆抗體可減慢鼠淋巴瘤EL-4細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖，與時間呈正性相關(guān)。
　　 2.經(jīng)CTLA-4單克隆抗體治療后的裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，其浸潤程度降低.
　　 3.裸鼠腫瘤組織于CTLA-4單克隆抗體治療4周后，腫瘤組織CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞浸潤比例降低。