不同給藥方式下三氧化二砷對(duì)裸鼠T細(xì)胞淋巴瘤模型體內(nèi)及體外作用實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 惡性淋巴瘤(malignantlymphoma)是淋巴結(jié)及其他器官中的淋巴組織惡性腫瘤，是造血系統(tǒng)常見(jiàn)惡性疾病之一，分為霍奇金病(Hodgkin'sdisease，HD)及非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin'slymphoma，NHL)兩大類(lèi)。在我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤中占第8位，每年發(fā)病2～4/10萬(wàn)人口。目前，T細(xì)胞來(lái)源的非霍奇金淋巴瘤(NHL)化療效果較B細(xì)胞來(lái)源的NHL差，預(yù)后不良，特別是復(fù)發(fā)難治T細(xì)胞NHL預(yù)后

2、兇險(xiǎn)。挽救方案均有一定的療效，有效率在30﹪～50﹪，緩解時(shí)間較短，長(zhǎng)期緩解約為10﹪，自體造血干細(xì)胞支持下的超大劑量化療，能夠明顯提高遠(yuǎn)期療效，但仍有相當(dāng)部分復(fù)發(fā)NHL死于本病。因此，臨床上仍需尋找新的藥物以期能進(jìn)一步改善NHL患者預(yù)后。 三氧化二砷在20世紀(jì)中后期治療急性早幼粒細(xì)胞白血病取得了滿意的效果，隨著對(duì)砷劑了解的逐步加深，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已不僅局限應(yīng)用As<,2>O<,3>治療急性早幼粒細(xì)胞白血病，不少學(xué)者正在試用于惡性淋

3、巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等惡性血液病及肝癌等實(shí)體腫瘤，基礎(chǔ)研究及臨床研究均顯示出誘人的應(yīng)用前景。國(guó)內(nèi)外基礎(chǔ)研究顯示As<,2>O<,3>體外單藥、聯(lián)合其他藥物及方法如放療等均可以抑制多種惡性淋巴瘤細(xì)胞株的增殖。臨床方面，單藥As<,2>O<,3>治療復(fù)發(fā)難治性惡性淋巴瘤有效率約在21.4﹪～75﹪之間，大多數(shù)報(bào)道臨床不良反應(yīng)輕。所以，不少報(bào)道認(rèn)為As<,2>O<,3>是值得在復(fù)發(fā)耐藥NHL深入研究的藥物之一。國(guó)內(nèi)外多篇As<,2>O<,3>有

4、關(guān)人體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示目前常規(guī)劑量給藥后3-4h達(dá)藥物峰濃度，在人體內(nèi)代謝呈二房室模型特征，其代謝產(chǎn)物清除主要通過(guò)尿液，并且清除迅速，僅在部分組織內(nèi)蓄積，無(wú)明顯血液蓄積作用，可應(yīng)用于嚴(yán)重腎功能不良的患者。當(dāng)前臨床常規(guī)用藥多采用單次多天方式，即0.1～0.2mg/kg，連續(xù)治療14天左右。根據(jù)國(guó)內(nèi)外臨床使用本藥物經(jīng)驗(yàn)，嚴(yán)重副反應(yīng)報(bào)道少見(jiàn)，多表現(xiàn)為肝功能輕度異常，Q-T間期延長(zhǎng)及輕度消化道反應(yīng)等，安全性較佳。因此，按照藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)及目

5、前臨床不良反應(yīng)情況，結(jié)合當(dāng)前每天較低劑量較長(zhǎng)時(shí)間的給予As<,2>O<,3>的問(wèn)題，故考慮是否可以改變目前給藥方式，探討加大每天劑量，縮短整體治療時(shí)間的可行性。 目的： 本文基于國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者在As<,2>O<,3>在治療惡性淋巴瘤的臨床及基礎(chǔ)學(xué)研究結(jié)論，試圖通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，改變常規(guī)As<,2>O<,3>給藥方式探討相同總治療劑量下．As<,2>O<,3>不同給藥方式治療淋巴瘤的可行性及相關(guān)不良反應(yīng)研究。本文主要目的

6、通過(guò)Annexin V/PI雙染色法、流式細(xì)胞儀及MTT法檢測(cè)三氧化二砷對(duì)鼠源性T細(xì)胞淋巴瘤EL4細(xì)胞株的體外抑制作用，驗(yàn)證體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可行性。進(jìn)一步建立裸鼠T細(xì)胞淋巴瘤動(dòng)物模型，采用不同給藥方式研究三氧化二砷對(duì)動(dòng)物體內(nèi)T細(xì)胞淋巴瘤抗瘤作用，著重觀察As<,2>O<,3>對(duì)腫瘤抑瘤率和了耐受性等。初步了解As<,2>O<,3>新的給藥方法對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤療效及不良反應(yīng)的變化情況。為臨床更合理應(yīng)用As<,2>O<,3>提供新的科學(xué)依據(jù)。

7、 1．As<,2>O<,3>對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤株EL4的體外實(shí)驗(yàn)研究 通過(guò)MTT法檢測(cè)8種濃度的三氧化二砷對(duì)鼠源性T細(xì)胞淋巴瘤EL4細(xì)胞株的作用，在Spectra Max M2酶標(biāo)儀上以試驗(yàn)波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)450nm測(cè)定光密度值(OD值)，按照公式：抑制率(﹪)=[(OD陰性孔．OD給藥孔)/OD陰性孔]×100﹪測(cè)定三氧化二砷對(duì)EL4細(xì)胞株抑率。流式細(xì)胞儀分析、Annexin-V-FITC/PI雙標(biāo)記及電鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例

8、及凋亡形態(tài)變化。結(jié)果顯示：各濃度組的As<,2>O<,3>對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤EL4細(xì)胞均存在直接抑制作用，并呈時(shí)間及劑量依賴(lài)性。流式細(xì)胞分析各濃度均對(duì)EL4細(xì)胞有一定抑制作用，隨著濃度的增大，凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。熒光顯微鏡觀察到腫瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)。電鏡下出現(xiàn)典型細(xì)胞凋亡小體。 2．As<,2>O<,3>對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤荷瘤裸鼠移植瘤生長(zhǎng)作用的實(shí)驗(yàn)研究 建立T細(xì)胞淋巴瘤EL4細(xì)胞荷瘤裸鼠移植瘤模型，隨機(jī)分組為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，具體

9、分組如下：A14組：As<,2>O<,3> 4mg/kg，dl-7，停藥觀察至d14；A7組：As<,2>O<,3> 4mg/kg，dl-7；B14組：As<,2>O<,3> 2mg/kg，dl-14；對(duì)照組：生理鹽水，dl-14，腹腔注射。檢測(cè)腫瘤體積變化和瘤重，計(jì)算抑瘤率，光鏡下觀察腫瘤組織病理學(xué)改變，并行組織學(xué)觀察肝臟病理變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)速度減慢，各實(shí)驗(yàn)組抑瘤率分別為：A7組77.9﹪，A14組58.8﹪，

10、B14組55.6﹪。A14組較B14組療效稍好，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故認(rèn)為4mg/kg×7天組與2mg/kg×14天組療效相當(dāng)。藥物不良反應(yīng)方面：實(shí)驗(yàn)組A7 2只裸鼠及A14組1只裸鼠出現(xiàn)體重下降現(xiàn)象，其中A7組1只裸鼠24小時(shí)體重下降超過(guò)1g，并于實(shí)驗(yàn)第6日死亡，另外A14組1只裸鼠于實(shí)驗(yàn)第10日死亡，另外1只裸鼠在停藥后體重逐漸增長(zhǎng)。各實(shí)驗(yàn)組分別在給藥結(jié)束后1天檢測(cè)血常規(guī)，A7組全部裸鼠白細(xì)胞較A14、B14組明顯下降，A7組1只裸

11、鼠血小板下降明顯。根據(jù)臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)劑量，推測(cè)人體臨床試驗(yàn)單次使用參考劑量應(yīng)小于30mg/d。 結(jié)論： 1．As<,2>O<,3>體外實(shí)驗(yàn)表明可抑制T細(xì)胞淋巴瘤EL4細(xì)胞株生長(zhǎng)。 2．流式細(xì)胞儀分析及Annexin-v-FITC和PI雙標(biāo)記檢測(cè)表明As<,2>O<,3>主要作用機(jī)制為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 3．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明As<,2>O<,3>相同總劑量下，4mg/kg×7天與2mg/kg×14天的給