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文檔簡介
1、目的:探究晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced Glycation End Products,AGEs)對人主動脈血管平滑肌細(xì)胞(Human Aorta Vascular Smooth Muscle Cells,HASMCs)增殖和遷移的影響,進(jìn)而探究ERK1/2、P38MAPK、JNK及AKT等相關(guān)信號通路是否參與HASMCs增殖和遷移。進(jìn)一步探究AGEs是否與其受體RAGE以配體-受體相結(jié)合方式啟動其下游信號通路參與HASMCs的增
2、殖與遷移。為糖尿病血管動脈粥樣硬化,血管腔內(nèi)成形術(shù)(Percutaneous Transluminal Angioplasty,PTA)術(shù)后再狹窄等狹窄、閉塞性病變的防治提供新的策略。
方法:CCK-8法及EdU法檢測HASMCs在不同濃度AGEs作用下增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測上述對應(yīng)濃度條件下的AGEs對HASMCs周期轉(zhuǎn)換情況;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)測定HASMCs在上述對應(yīng)濃度條件的AGEs刺激下其遷移情況
3、,羅丹明-鬼筆環(huán)肽熒光染色后,通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察HASMCs纖維肌動蛋白(F-actin)的表達(dá)情況;蛋白印跡技術(shù)(western blot)測定平滑肌細(xì)胞增殖與遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;PD98059(ERK1/2 inhibitor),SB203580(P38 inhibitor),SP600125(JNK inhibitor),LY294002(AKT inhibitor)分別預(yù)處理HASMCs,1小時(shí)之后,再加入一定濃度
4、的AGEs,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24~48h,通過上述實(shí)驗(yàn)方法檢測HASMCs增殖和遷移能力以及與增殖和遷移相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)情況;經(jīng)過以上實(shí)驗(yàn)的初步探索,我們發(fā)現(xiàn)抑制AKT信號通路之后,HASMCs的增殖和遷移活性均被明顯抑制,表明AKT通路在AGEs誘導(dǎo)的HASMCs增殖和遷移過程中同時(shí)發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。故實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步選用AKT-siRNA轉(zhuǎn)染HASMCs構(gòu)建起AKT被干擾的細(xì)胞模型,同時(shí)選用RAGE-RANi慢病毒轉(zhuǎn)入細(xì)胞構(gòu)建起RAGE基因
5、沉默的HASMCs模型,以探究AGEs/RAGE軸與AKT信號通路之間的關(guān)系。慢病毒載體上標(biāo)記有綠色熒光蛋白基因(Green Fluorescein Protein,GFP),當(dāng)細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染病毒后,可以穩(wěn)定表達(dá)GFP,通過熒光顯微鏡可以觀察HASMCs的轉(zhuǎn)染效率,western blot檢測AKT蛋白和RAGE蛋白的以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。轉(zhuǎn)染成功后,經(jīng)AGEs干預(yù)、誘導(dǎo),再通過western blot測定RAGE、AKT以及增殖和遷移相
6、關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
結(jié)果:
1、在一定濃度范圍內(nèi),AGEs能促進(jìn)HASMCs增殖和遷移。當(dāng)AGEs濃度在0~10mg/l范圍內(nèi)時(shí),HASMCs增殖活性逐漸增強(qiáng),在10mg/l時(shí)細(xì)胞增殖數(shù)量達(dá)最高峰,超出范圍后其增殖活性逐漸減弱,且濃度超過40mg/l后,細(xì)胞開始凋亡;當(dāng)AGEs濃度在0~20mg/l范圍內(nèi)時(shí),HASMCs遷移活性逐漸增強(qiáng),在20mg/l時(shí)細(xì)胞遷移數(shù)量達(dá)最高峰,超出范圍后其遷移能力逐漸減弱。
7、2、HASMCs經(jīng)PD98059(20μmol/l)預(yù)處理后,其增殖活性被顯著抑制(P<0.05,n=3);同時(shí)觀察到JNK的特異性抑制劑SP600125(40μmol/l)能顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞遷移(P<0.05,n=3);而HASMCs經(jīng)SB203580預(yù)處理后其增殖與遷移均無明顯抑制效應(yīng)(P>0.05,n=3);但同時(shí)我們也觀察到,HASMCs經(jīng)LY294002(40μmol/l)預(yù)處理后,其增殖和遷移活性均被明顯抑制
8、P<0.05,n=3);
3、HASMCs轉(zhuǎn)染AKT-siRNA后,經(jīng)western blot檢測,與對照組相比較,轉(zhuǎn)染AKT-siRNA組細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白表達(dá)明顯下調(diào)P<0.01,n=3)。
4、HASMCs轉(zhuǎn)染RAGE-RANi慢病毒5天后,熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光,且經(jīng)western blot檢測,與對照組相比較,轉(zhuǎn)染RAGE-RANi組細(xì)胞內(nèi)RAGE蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01,n=3)。
9、> 5、HASMCs的AKT基因被干擾后,其增殖、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05,n=3),而當(dāng)其RAGE基因被沉默后,AKT蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),同時(shí),增殖、遷移相關(guān)蛋白也明顯下調(diào)(P<0.05,n=3)。
結(jié)論:
1、AGEs能促進(jìn)HASMCs增殖和遷移,且在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為濃度依賴性。
2、ERK1/2和JNK分別參與AGEs誘導(dǎo)的HASMCs增殖和遷移,AKT同時(shí)參與AGEs誘導(dǎo)的HASMC
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