AMPK-AP-2α-IkBα通路抗AS的作用和機(jī)制以及相關(guān)藥物干預(yù)研究.pdf

1、AS是一種有基因突變、環(huán)境刺激、代謝異常等多種因素相互作用的多因素疾病。AS的病因以及機(jī)制復(fù)雜不明，目前研究顯示吸煙、高齡、高血壓、男性性別、高膽固醇血癥和糖尿病是導(dǎo)致AS的主要危險因素。臨床上急性冠狀動脈綜合征如果合并糖尿病30天和1年的死亡率顯著高于無糖尿病患者。糖尿病與心血管事件遠(yuǎn)遠(yuǎn)不是血糖水平高低的點(diǎn)對點(diǎn)的因果關(guān)系，糖尿病有我們未發(fā)現(xiàn)的獨(dú)立于血糖升高之外的機(jī)制促進(jìn)動脈粥樣硬化。
　　AMPK是細(xì)胞能量代謝的感受器。研究發(fā)現(xiàn)

2、敲除小鼠編碼AMPKα2的基因，血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為IkBα蛋白水平下降、NF-κB活化、NADPH氧化酶的蛋白表達(dá)上調(diào)以及大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生。有關(guān)AMPK在AS中的作用，近期發(fā)現(xiàn)二甲雙胍或降脂藥他汀類等均能激活A(yù)MPK，產(chǎn)生內(nèi)皮保護(hù)作用及抗AS作用。二甲雙胍是目前臨床廣泛應(yīng)用的口服降糖藥。
　　既往也有研究發(fā)現(xiàn)AMPKα2活化后可以直接進(jìn)入細(xì)胞核并磷酸化A

3、P-2α第219絲氨酸殘基，上調(diào)其轉(zhuǎn)錄活性，最終參與了吸煙所誘導(dǎo)的腹主動脈瘤(AAA)形成。轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白2α（Activator Protein，AP-2α）是一種轉(zhuǎn)錄因子，屬于AP-2家族，包括α、β、γ、δ和ε等5個成員，一種典型的結(jié)合序列為GCCXXXGGC。而我們分析IkBα的基因啟動子上含有AP-2α的作用結(jié)構(gòu)域。
　　綜上所述，我們提出科學(xué)假說:二甲雙胍通過激活A(yù)MPK，通過上調(diào)AP-2α/IkBα通路，抗動脈粥樣

4、硬化斑塊形成以及穩(wěn)定斑塊的作用。
　　目的：
　　(1)AMPK激活后是否通過AP-2α上調(diào)IkBα的基因表達(dá);
　　(2)二甲雙胍是否通過激活A(yù)P-2α/IkBα抗AS。
　　方法：
　　1、凝膠遷移或電泳遷移率檢測(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)
　　將IκBα基因啟動子（200和1400bp）的DNA與AP-2α重組蛋白在反應(yīng)緩沖液中溫育。分

5、離混合物，SYBR Green檢測DNA與SYPRO Ruby檢測蛋白從而檢測AP-2α和NF-κB的相互作用。
　　2、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)
　　收集細(xì)胞蛋白，用ChIP測定AP-2α與IκBα基因啟動子的結(jié)合能力。
　　3、細(xì)胞培養(yǎng)
　　(1)小鼠平滑肌細(xì)胞應(yīng)用1mM AICAR刺激細(xì)胞24h。收集細(xì)胞提取蛋白檢測AMPK、AP-2α、IκBα的蛋白表達(dá)。
　　(2)小鼠平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cont

6、rol shRNA和AP-2α shRNA干擾AP-2α的表達(dá)后，1mM AICAR刺激細(xì)胞24h，收集細(xì)胞檢測IkBα的表達(dá)。
　　(3)小鼠平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Control shRNA和AP-2α shRNA后，50ng/μL的TNF和1 mM AICAR刺激24小時，DHE測定活體細(xì)胞ROS的水平。
　　4、構(gòu)建AP-2α慢病毒載體
　　構(gòu)建三個不同序列的干擾AP-2α的慢病毒載體。轉(zhuǎn)染MOVAS細(xì)胞證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子AP

7、-2α干擾效果，篩選干擾效果最優(yōu)序列。
　　5、動物模型的建立
　　(1)雄性ApoE-/-小鼠均購買周齡為8-10周的，給予普食喂養(yǎng)1周后慢病毒尾靜脈注射。根據(jù)轉(zhuǎn)染病毒的不同以及是否給予二甲雙胍干預(yù)，將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為4組:(1) Control shRNA組;(2) Control shRNA給予二甲雙胍藥物干預(yù)組;(3) AP-2α shRNA組;(4) AP-2α shRNA給予二甲雙胍藥物干預(yù)組組。4周后

8、，給予300mg/kg/天的二甲雙胍。所有小鼠全程高脂飲食，8周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，ApoE-/-小鼠被處以安樂死。
　　(2)雄性ApoE-/-小鼠均購買周齡為8-10周的，給予普食喂養(yǎng)1周后給予頸總動脈套管手術(shù)并給予慢病毒尾靜脈注射。根據(jù)轉(zhuǎn)染病毒的不同以及是否給予二甲雙胍干預(yù)，將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為4組，(1) Control shRNA組;(2)Control shRNA給予二甲雙胍藥物干預(yù)組;(3) AP-2αshRNA組;

9、(4) AP-2αshRNA給予二甲雙胍藥物干預(yù)組。4周后，給予300mg/kg/天的二甲雙胍飲水，并再次給與尾靜脈病毒注射。所有小鼠全程高脂飲食，結(jié)束實(shí)驗(yàn)后，小鼠處安樂死取材進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　6、代謝指標(biāo)的測定
　　試驗(yàn)結(jié)束后，小鼠均麻醉后進(jìn)行體重測量。小鼠被麻醉后后行心臟左心室穿刺采血，檢測血清中代謝相關(guān)指標(biāo)。
　　7、組織病理學(xué)測定
　　分別制備主動脈根部和頸動脈斑塊組織的冰凍切片，HE染色測定斑塊負(fù)荷，

10、α-SMA和MOMA-2分別測定平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞含量，天狼猩紅染色和油紅O染色分別測定膠原含量和脂質(zhì)含量，測定易損指數(shù)。免疫組化染色測定斑塊組織內(nèi)AP-2α;4-HNE;3-NT; Nox4; p47; IKBα。
　　8、Western blot
　　取出凍存與-80℃冰箱中主動脈根部及右側(cè)頸動脈組織，提取蛋白，檢測AP-2α的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、AP-2α能夠與IκBα的啟動子特異結(jié)合
　　

11、EMSA測定發(fā)現(xiàn)AP-2α重組蛋白能夠與IkBα的DNA體外相互作用。ChIP測定發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)AP-2α蛋白能夠和IkBα的基因啟動子相互結(jié)合。
　　2、AMPK活化增加了AP-2α與IκBα的表達(dá)
　　Westernblot結(jié)果顯示AICAR激活A(yù)MPK后，增加了磷酸化AP-2α和IκBα的表達(dá)。
　　3、激活A(yù)MPK后，需要通過AP-2上調(diào)IkBα的蛋白表達(dá)
　　AP-2αshRNA干擾AP-2α后，激活A(yù)M

12、PK不能明顯增加IkBα的蛋白表達(dá)。
　　4、激活A(yù)MPK后，需要通過AP-2α抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)
　　DHE測定活細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)，AP-2α shRNA干擾AP-2α后，激活A(yù)MPK并不能抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。
　　5、ApoE-/-小鼠代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測
　　體重和血脂檢測結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠各組無顯著差異。
　　6、慢病毒在主動脈根部斑塊組織中干擾效率主動脈根部斑塊組織內(nèi)可見明顯GF

13、P綠色熒光。
　　免疫組化以及Westernblot測定主動脈根部組織中AP-2α的蛋白表達(dá)量，慢病毒可以有效的干擾AP-2α的表達(dá)。
　　7、慢病毒在頸動脈斑塊組織中的干擾效率
　　頸動脈易損斑塊模型的實(shí)驗(yàn)中，病毒轉(zhuǎn)染2周后，GFP在頸動脈斑塊組織內(nèi)的表達(dá)含量明顯增加。Westernblot以及免疫組化結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染明顯的減少了斑塊組織中AP-2α的蛋白表達(dá)。
　　8、二甲雙胍通過激活A(yù)P-2α增加IK-

14、Bα的表達(dá)
　　免疫組化的結(jié)果顯示二甲雙胍需要通過激活A(yù)P-2α增加IK-Bα的表達(dá)，慢病毒干擾減少了AP-2α表達(dá)后，二甲雙胍不能明顯增加IK-Bα在斑塊組織中的表達(dá)。
　　9、二甲雙胍通過激活A(yù)P-2α抑制頸動脈斑塊組織內(nèi)氧化應(yīng)激
　　與Control shRNA組比較，二甲雙胍不能明顯減少AP-2α shRNA組頸動脈斑塊組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的表達(dá)。
　　10、二甲雙胍抗動脈粥樣硬化作用需要通過激活A(yù)P-2α