模式生物斑馬魚藥物依賴模型的建立以及中藥的干預機制.pdf

1、背景
　　 目前，苯丙胺類中樞興奮劑(amphetamine-typestimulants，ATS)濫用增長勢頭迅猛，世界五大洲21個國家的興奮劑濫用人數已超過海洛因和可卡因濫用人數之和，呈全球蔓延之勢。歐洲7個國家的一項調查表明，ATS已成為第二大類最常濫用的成癮物質。在我國，苯丙胺類中樞興奮劑等新型毒品濫用形勢嚴峻，又因其嚴重損害中樞神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等器官功能，易發(fā)生群體淫亂、人身攻擊等暴力，引起社會和公共衛(wèi)生問題，嚴重

2、敗壞社會風氣，因而研制針對其依賴及其戒斷癥狀的治療藥物意義深遠。在我國中醫(yī)藥戒毒已經有200多年歷史，積累了豐富的經驗，形成了一套特有的理論和方法。中醫(yī)藥戒毒以扶助正氣，排解煙毒為治療思想，突出辨證論治的特色。中藥療法具有低毒價廉、藥源廣泛、無成癮性等獨特的優(yōu)勢，注重從病證出發(fā)，辨證施治，因此戒毒中藥很可能在戒毒問題上取得突破性進展。
　　 大量研究結果表明中樞谷氨酸神經系統(tǒng)與藥物依賴有著密切的聯系，有關NMDA受體和AMPA受

3、體與藥物依賴的報道較多，而TH作為多巴胺合成的關鍵酶在藥物依賴形成過程中也起著十分重要的作用，但相關的報道不多。用綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)標記TH是一種新的分子生物學技術，它使TH表達的變化變得更加直觀。GFP是一種能夠在活細胞中表達的發(fā)光蛋白，不需要外源底物或輔助因子，在藍光的激發(fā)下能發(fā)出綠色熒光。GFP作為熒光標記分子，既具有敏感的標記檢測率，又沒有放射性的危害。
　　 條件性位

4、置偏愛(conditionedplacepreference，CPP)實驗是一種通過測定實驗動物對體驗藥物效應的位置是否產生偏愛，從而評價藥物精神依賴性潛力的有效方法。目前關于藥物精神依賴的研究的實驗動物，多集中嚙齒類的大鼠、小鼠等，而隨著越來越多樣化的毒品的出現，我們需要尋找新的可用的模式生物作為傳統(tǒng)模式生物的補充，應用于成癮醫(yī)學領域。
　　 斑馬魚作為一種新型模式動物，與大鼠、小鼠等哺乳動物相比，由于其交配行為受光周期控制、

5、產卵量多、受精卵在體外受精、繁殖周期快、易于飼養(yǎng);而且前期胚胎整體透明，易于活體觀察等優(yōu)點，斑馬魚在行為學中的應用前景逐漸被研究者所認識。
　　 實驗目的
　　 1.擬建立成年斑馬魚的甲基苯丙胺CPP動物模型，觀察成年斑馬魚CPP效應，從行為學方面來評估成年斑馬魚的依賴效果，同時用中藥有效成分進行干預，觀察形成依賴后成年斑馬魚的行為變化。
　　 2.采用蛋白免疫印跡(Westernblotting)方法，觀察甲基

6、苯丙胺條件性位置偏愛成年斑馬魚腦內NR2B受體、GluR2受體和TH受體表達的改變及中藥活性成分鉤藤總堿對其干預后是否發(fā)生變化。
　　 3.用GFP來標記多巴胺合成的關鍵酶—TH，然后利用轉基因技術培育出TH—GFP轉基因斑馬魚，通過觀察轉基因斑馬魚幼魚頭部熒光的強弱來判斷其甲基苯丙胺依賴程度，同時初步摸索對于斑馬魚幼魚大葉鉤藤水提物的有效濃度。
　　 4.證實斑馬魚是一個研究苯丙胺類興奮劑依賴的理想模型和進一步研究斑馬

7、魚的甲基苯丙胺依賴的作用機理以及中藥對其的干預機制提供實驗證據。
　　 實驗方法
　　 1.成年斑馬魚條件性位置偏愛模型的建立:根據文獻以及預實驗結果可知成年斑馬魚的天然偏愛箱為褐色箱，故選擇透明箱作為伴藥箱。給藥前用動物行為學分析系統(tǒng)對實驗成年斑馬魚進行位置偏愛測定，剔除不符合天然偏愛習慣的動物。測定前將實驗箱中間隔板抽出，當成年斑馬魚處于兩個箱體之間時開始計時，逐條觀察15min，以成年斑馬魚頭部為準，記錄成年斑馬魚

8、在白箱中的停留時間。取經過自然位置偏愛測定合格的成年斑馬魚20條，按隨機分組原則分為:①正常對照組，②甲基苯丙胺模型組。d1將斑馬魚置于獨立的用于訓練的CPP箱，每個CPP箱的水位不低于5cm，以保證足夠的水壓，適應性喂養(yǎng)至少2d。于d3測試正常狀態(tài)下，所有斑馬魚的位置偏愛箱（15min內），并且用Noldus動物行為學分析系統(tǒng)來跟蹤其路線圖（5min內）。d4、d6、d8，將甲基苯丙胺模型組斑馬魚用tricaine麻醉后，置于柔軟粗糙

9、面上，用微量注射器，迅速腹腔注射甲基苯丙胺(40μg/g)，將其置于伴藥箱45min，伴藥箱與偏愛箱之間用一個透明擋板隔開，使魚不能游過去，但又不會遮擋其視線。45min后，將魚移至較大的有藍色環(huán)境的魚缸，并且用70％的乙醇清潔CPP箱，最后用系統(tǒng)水沖洗?？瞻捉M注射等體積魚用生理鹽水，其他處理與模型組一致。d5、d7，在與d4注射的同一時間，斑馬魚用相同方法注射等體積的魚用生理鹽水，按相同的步驟，對斑馬魚進行訓練。最后一次注射24h后(

10、即d9)，測試所有斑馬魚的伴藥箱停留時間以及在魚缸的路線圖，比較它們在伴藥箱前后停留時間的差值。
　　 2.鉤藤總堿對甲基苯丙胺依賴成年斑馬魚的影響:
　　 2.1鉤藤總堿對甲基苯丙胺依賴成年斑馬魚CPP的影響:取經過自然位置偏愛測定合格的成年斑馬魚50條，按隨機分組原則分為:①正常對照組，②甲基苯丙胺模型組，③模型+鉤藤總堿低劑量組(50μg/g)，④模型+鉤藤總堿高劑量組(100μg/g)，⑤模型+氯胺酮組(150μ

11、g/g)。整個實驗需要進行9d，d1將斑馬魚置于獨立的用于訓練的CPP箱，每個CPP箱的水位不低于5cm，以保證足夠的水壓，適應性喂養(yǎng)至少2d。d3測試正常狀態(tài)下，所有斑馬魚的位置偏愛箱（15min內），并且用Noldus動物行為學分析系統(tǒng)來跟蹤其路線圖（5min內）。在d4、d6、d8，將除開空白組以外的所有斑馬魚浸入200mg/Ltricainemethanesulfonate溶液中麻醉，用微量注射器迅速腹腔注射甲基苯丙胺(40μg

12、/g)，然后將其置于非偏愛箱（伴藥箱）45min。之后的訓練步驟與建立模型的訓練步驟相同。12h后，將除開空白組以外的所有斑馬魚再次浸入200mg/Ltricainemethanesulfonate溶液中麻醉，用微量注射器迅速腹腔注射相應的處理藥物（模型組注射等體積生理鹽水，低劑量組注射50μg/g鉤藤總堿溶液，高劑量組注射100μg/g鉤藤總堿溶液，氯胺酮組注射150μg/g氯胺酮溶液），之后將其移至較大的有藍色環(huán)境的魚缸?？瞻捉M斑馬

13、魚用200mg/Ltricainemethanesulfonate溶液麻醉后注射等體積魚用生理鹽水，其他處理與模型組一致。d5和d7在與d4注射的同一時間，給予斑馬魚注射等體積的魚用生理鹽水，然后將其置于偏愛箱（非伴藥箱）45min。按上述相同的步驟，對斑馬魚進行訓練。最后一次注射24h后(即d9)，測試所有斑馬魚的伴藥箱停留時間以及在魚缸的路線圖，比較它們在伴藥箱前后停留時間的差值。
　　 2.2鉤藤總堿對甲基苯丙胺依賴成年斑

14、馬魚腦內NR2B、GluR2和TH表達的影響:完成CPP測定后，將成年斑馬魚冷凍處死，取腦。將取出的腦，放入EP管中，加入適量的LysisBuffer，冰浴勻漿。之后于其后于4℃，14000rpm離心10min，取其上清液。每組取上清液2μl，將其稀釋20倍，從稀釋液中取5μl至96孔板，每組取3次，共15μl。然后，在96孔板每孔中加入ProteinAssayReagentA25μl、ProteinAssayReagentB200μl

15、。避光，緩慢振搖30min后，測蛋白濃度，放至-80℃凍存。配制好實驗所需的溶液，待用。配制凝膠:一、分離膠，取10ml塑料離心管一支，分別加入MilliQ2.85ml、1.0MTris-HCl(PH=8.8)3ml、30％Acrylamide2.15ml、10％SDS40μl、10％APS40μl，灌膠前加入TEMED8μl，混勻，灌膠。二、濃縮膠，取10ml塑料離心管一支，分別加入MilliQ2.1ml、1.0MTris-HCl(P

16、H=6.8)0.375ml、30％Acrylamide0.375ml、10％SDS15μl、10％APS22.5μl，待分離膠凝好后，加入TEMED4.5μl，混勻，灌膠。SDS-PAGE電泳:將電泳槽加入足夠電泳液后，準備上樣。每組蛋白按30μg上樣，兩端，分別上MagicMark和DualMark。前40min，以40V，130mA電泳。40min之后，DualMark會逐漸分開，將電壓加大，以70V，130mA電泳。轉膜:在電泳結

17、束前約5min，配制好TransferBuffer。剪一張與分離膠差不多大小的PVDF膜，剪去一角，用100％甲醇浸潤。取2塊MiniTransBlotFilterpaper，與浸潤好的PVDF膜一起放入TransferBuffer中。電泳結束后，將濃縮膠與分離膠小心剝離，然后將分離膠輕輕取出，放入TransferBuffer中。從下至上，按照夾子黑色面—Filterpaper—分離膠—PVDF膜—Filterpaper—夾子紅色面的順

18、序做好“三明治”。將“三明治”放入轉移槽中，加入足夠的TransferBuffer，以15V，110mA，室溫，攪拌，電轉過夜。一抗、二抗的孵育:取出已轉好的PVDF膜，室溫下，在搖床上用1×TBST洗3次，每次10min，之后再用1×TBS洗10min。洗完后，用5％的脫脂牛奶在搖床上封閉1h。將封閉好的PVDF膜正面向上，涂上稀釋成適當濃度的一抗，室溫下靜置2h。2h后，取出PVDF膜，于室溫下，在搖床上用1×TBST洗3次，每次5

19、min，之后再用1×TBS洗5min。將洗好的PVDF膜正面向上，涂上稀釋成適當濃度的二抗，室溫下靜置1h。按照洗一抗的方法，洗去二抗。顯影、定影:在最后一遍洗滌時，準備好ECL發(fā)光液，將其置于保鮮膜上，將洗好的PVDF膜，慢慢地蓋上（確保沒有氣泡），包好，放入X—光片夾。在暗室中，將1×的顯影液和定影液分別倒入塑料托盤中，在紅燈下取出X—光片，并剪成合適大?。ū萈VDF膜略大）。打開X—光片夾，將剪好的X—光片覆蓋在PVDF膜上，合上

20、X—光片夾，根據信號強弱來調整曝光時間。拿出曝光好的X—光片，浸入顯影液中，直到出現明顯條帶后，取出，用清水漂洗后，放入定影液2-5min，取出再用清水清洗。掃描特異條帶，用Metamorph軟件分析每個特異條帶的OD值。
　　 3.斑馬魚幼魚藥物依賴模型的建立以及給藥劑量的初步探索:選取10對繁殖正常的成年斑馬魚，于繁殖前一天晚上分別放入10個繁殖缸中，雄魚和雌魚中間用透明隔板分開，過夜。第二天上午，做好顯微注射的準備之后，抽

21、開中間隔板，迅速向卵黃囊中注射TH—GFP質粒。然后，將注射完的魚卵，放入恒溫恒濕箱。12小時后，將普通eggwater換成含PTU的eggwater。5天后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察是否轉基因成功。顯微注射后第五天，取轉基因成功并且已經能自由游動的斑馬魚幼魚12條，按隨機分組原則分為:①甲基苯丙胺（60mg/L）模型組，②甲基苯丙胺(6mg/L)模型組，③甲基苯丙胺(0.6mg/L)模型組，④甲基苯丙胺(0.06mg/L)模型組。將

22、每組斑馬魚幼魚放入相應濃度的甲基苯丙胺溶液中自由游動，禁食。3天后，取出。用PBST漂洗5min后，再用4％PFA固定，過夜。第二天，取出固定好的斑馬魚幼魚，用PBST漂洗3次，每次5min。然后將固定好的斑馬魚幼魚放入液態(tài)的低熔點瓊脂糖中，調整好位置，待其凝固后，用熒光體視顯微鏡觀察其熒光變化。
　　 濃度摸索:顯微注射后第五天，取轉基因成功并且已經能自由游動的斑馬魚幼魚21條，按隨機分組原則分為:①大葉鉤藤水提物(1g/mL

23、)組，②大葉鉤藤水提物（0.33g/mL）組，③大葉鉤藤水提物（0.033g/mL）組，④大葉鉤藤水提物（0.0033g/mL）組，⑤大葉鉤藤水提物（0.00033g/mL）組，⑥甲基苯丙胺（0.6mg/L）模型組，⑦空白對照組。除第⑦組外，將每組斑馬魚幼魚放入0.6mg/L的甲基苯丙胺溶液中自由游動，禁食。3天后，將第①組—第⑤組的斑馬魚幼魚取出，放入相應濃度的大葉鉤藤水提物中，第⑥組放入清水中，自由游動。24h后，將所有斑馬魚幼魚取

24、出，用PBST漂洗5min后，再用4％PFA固定，過夜。第二天，取出固定好的斑馬魚幼魚，用PBST漂洗3次，每次5min。然后將固定好的斑馬魚幼魚放入液態(tài)的低熔點瓊脂糖中，調整好位置，待其凝固后，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察其熒光變化。
　　 實驗結果
　　 1.從實驗結果可以看出，空自對照組成年斑馬魚和甲基苯丙胺模型組成年斑馬魚在非偏愛箱前后停留時間的差值，通過兩獨立樣本t檢驗(P=0.000)，表明兩組成年斑馬魚在非偏

25、愛箱前后停留時間的差值之間有顯著性差異。斑馬魚在魚缸的路線圖顯示，造模后，空白組造模前后的活動路線變化不顯著，而甲基苯丙胺模型組斑馬魚在偏愛箱活動的活動軌跡與造模前相比，有明顯減少。
　　 2.從實驗結果可以看出:模型組訓練前后在伴藥箱停留時間差與空白組訓練前后在伴藥箱停留時間差相比，有顯著性差異(P=0.000)，表明成年斑馬魚條件性位置偏愛模型建立成功。與模型組訓練前后在伴藥箱停留時間差相比，鉤藤總堿高劑量組(P=0.000

26、)和氯胺酮組(P=0.000)訓練前后在伴藥箱停留時間差有顯著性差異，而鉤藤總堿低劑量組訓練前后在伴藥箱停留時間差無明顯差別(P=0.949)。
　　 以適當比例稀釋抗體進行Westernblotting檢測，以β-actin為內標。與空白組成年斑馬魚相比，模型組成年斑馬魚腦內的TH表達有顯著性差異(P=0.001)，鉤藤總堿高劑量組成年斑馬魚(P=0.777)和氯胺酮組成年斑馬魚(P=0.546)腦內的TH表達無顯著差異，與甲

27、基苯丙胺模型組成年斑馬魚相比，鉤藤總堿高劑量組成年斑馬魚（P=0.001）和氯胺酮組成年斑馬魚(P=0.007)腦內的TH表達有顯著差異，鉤藤總堿低劑量組成年斑馬魚腦內的TH表達無顯著性差異(P=0.113)，與空白組成年斑馬魚相比，模型組成年斑馬魚(P=0.001)和鉤藤總堿低劑量組成年斑馬魚(P=0.01)腦內的NR2B表達有顯著性差異，鉤藤總堿高劑量組成年斑馬魚（P=0.083）和氯胺酮組成年斑馬魚(P=0.105)腦內的NR2B

28、表達無顯著差異，與空白組成年斑馬魚相比，模型組成年斑馬魚腦內的GluR2表達有顯著性差異(P=0.04)，鉤藤總堿高劑量組成年斑馬魚（P=0.334）和氯胺酮組成年斑馬魚（P=0.130）腦內的GluR2表達無顯著差異，與甲基苯丙胺模型組成年斑馬魚相比，鉤藤總堿高劑量組成年斑馬魚腦內的GluR2表達有顯著差異（P=0.003），鉤藤總堿低劑量組成年斑馬魚腦內的GluR2表達無顯著性差異(P=0.698)。
　　 3.轉基因結果顯

29、示，與正常斑馬魚幼魚相比，顯微注射TH—GFP質粒后的斑馬魚幼魚頭部出現明顯熒光。在綠色熒光下，與空白組斑馬魚幼魚相比，甲基苯丙胺(60mg/L)模型組斑馬魚幼魚頭部熒光變化明顯，甲基苯丙胺(6mg/L)模型組斑馬魚幼魚頭部熒光變化明顯，甲基苯丙胺(0.6mg/L)模型組斑馬魚幼魚頭部熒光變化明顯，而甲基苯丙胺(0.06mg/L)模型組斑馬魚幼魚頭部熒光變化則不明顯。將大葉鉤藤水提物(1g/mL)組斑馬魚幼魚，大葉鉤藤水提物(0.33g

30、/mL)組斑馬魚幼魚，大葉鉤藤水提物（0.033g/mL）組斑馬魚幼魚，大葉鉤藤水提物(0.0033g/mL)組斑馬魚幼魚，大葉鉤藤水提物（0.00033g/mL）組斑馬魚幼魚放入相應濃度的水提物中24h后，大葉鉤藤水提物(1g/mL)組斑馬魚幼魚，大葉鉤藤水提物(0.33g/mL)組斑馬魚幼魚，大葉鉤藤水提物（0.033g/mL）組斑馬魚幼魚和大葉鉤藤水提物（0.0033g/mL）組斑馬魚幼魚死亡，大葉鉤藤水提物(0.00033g/m

31、L)組斑馬魚幼魚游動正常。在共聚焦顯微鏡下，與空白組相比，甲基苯丙胺(0.6mg/L)模型組斑馬魚幼魚頭部熒光明顯增強。與甲基苯丙胺(0.6mg/L)模型組相比，大葉鉤藤水提物(0.00033g/mL)組斑馬魚幼魚頭部熒光有所減弱。
　　 結論
　　 1.甲基苯丙胺可以使成年斑馬魚產生明顯的位置偏愛效應，成年斑馬魚在伴藥箱中停留時間明顯延長，證明成年斑馬魚可以作為模式生物進行藥物依賴方面的研究。高劑量鉤藤總堿(100μg

32、/g)和氯胺酮(150μg/g)可顯著抑制甲基苯丙胺依賴成年斑馬魚的位置偏愛效應，使之與甲基苯丙胺模型組成年斑馬魚有顯著差異。而低劑量鉤藤總堿(50μg/g)對甲基苯丙胺依賴成年斑馬魚的位置偏愛效應沒有顯示出明顯的抑制效果。
　　 2.甲基苯丙胺依賴的形成會使正常成年斑馬魚腦內TH、NR2B、GluR2三種蛋白表達顯著上調。高劑量鉤藤總堿(100μg/g)和氯胺酮(150μg/g)可顯著抑制這種改變，使甲基苯丙胺依賴的成年斑馬魚

33、腦內的TH、NR2B、GluR2三種蛋白表達下調，而低劑量鉤藤總堿(50μg/g)對這種改變沒有明顯作用。
　　 3.可以利用TH—GFP轉基因斑馬魚，在顯微鏡下通過綠色熒光強弱來直觀的觀察斑馬魚甲基苯丙胺依賴情況，以及藥物對其的干預效果:0.6mg/L的甲基苯丙胺溶液就能使TH—GFP轉基因斑馬魚頭部熒光發(fā)生明顯增強，而濃度為0.00033g/mL大葉鉤藤水提物可以降低這種熒光的改變。
　　 注:本論文中的所有數據均采

34、用SPSS13.0進行分析。所有數據以((x)±SD)表示，各組成年斑馬魚在伴藥箱中的停留時間比較采用單向方差分析(One-WayANOVA)或者協(xié)方差分析(analysisofcovarinance，ANCOVA)，各組均數的多重比較采用最小顯著差值法(leastsignificantdifferent，LSD)，不滿足方差齊性要求的，采用Dunnett'sT3法。Westernblotting結果以每張轉印膜上目的蛋白條帶光密度值，