神經(jīng)酰胺在MCLR引起的HL7702細(xì)胞PP2A亞基及其底物改變中作用的探討.pdf

1、研究背景:微囊藻毒素LR(MCLR, microcystin-LR)是微囊藻毒素中存在最為普遍且毒性作用最明顯的一種。MCLR是蛋白磷酸酶2A(PP2A，protein phoshatase2A)的強(qiáng)抑制劑，對(duì)PP2A的抑制作用可能是造成其致毒作用機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜的原因之一。神經(jīng)酰胺是細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境刺激產(chǎn)生的一類主要的第二信使，PP2A/B55α亞基和PP2A/B56α亞基可被神經(jīng)酰胺激活。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，MCLR能夠刺激人胚腎細(xì)胞

2、HEK293和小鼠腎臟中神經(jīng)酰胺水平的升高，升高的神經(jīng)酰胺上調(diào)了HEK293細(xì)胞中PP2A/B55α以及PP2A/B56α這兩種調(diào)節(jié)亞基的蛋白水平。本研究擬探討MCLR染毒人肝細(xì)胞HL7702后神經(jīng)酰胺在PP2A亞基改變及其底物蛋白磷酸化水平改變中的作用。
　　研究方法:以人肝細(xì)胞系HL7702為模型，對(duì)細(xì)胞用MCLR染毒及用神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑Desipramine(DESI)處理，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測神經(jīng)酰胺水平，用免疫印跡技

3、術(shù)檢測PP2A各亞基蛋白水平及其底物MAPK、c-myc、Raf-1、Akt、bcl-2、Ezrin、VASP和Hsp27的總蛋白及磷酸化蛋白水平，用Hoechst33342染核方法檢測細(xì)胞凋亡。
　　研究結(jié)果:1.MCLR對(duì)HL7702細(xì)胞處理24小時(shí)后，神經(jīng)酰胺水平明顯升高。用10μM DESI與MCLR共處理HL7702細(xì)胞后，神經(jīng)酰胺水平的上升得到了抑制。2.MCLR與DESI共處理細(xì)胞后，MCLR引起的PP2A/B55α

4、和PP2A/B56α蛋白水平上調(diào)效應(yīng)消除。但是DESI共處理不影響MCLR引起的PP2A/A和PP2A/C亞基蛋白水平的變化。3.MCLR影響了PP2A底物MAPK、c-myc、Raf-1、Akt、bcl-2、Ezrin、VASP、Hsp27的磷酸化水平，其中c-myc、Akt、bcl-2、Hsp27在加入DESI后其磷酸化水平的升高被抑制。4.雖然bcl-2的磷酸化水平上升，但未檢測出MCLR對(duì)HL7702細(xì)胞的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生可見影響，