經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:現(xiàn)階段，用于研究干細(xì)胞的主要材料來(lái)源于胚胎干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但這兩種來(lái)源的干細(xì)胞都存在著部分的局限性，例如涉及創(chuàng)傷性、倫理道德性等，所以現(xiàn)臨床急需要尋找一種新型的干細(xì)胞以避免上述干細(xì)胞標(biāo)本倫理學(xué)的爭(zhēng)議、來(lái)源的缺乏及腫瘤形成的潛在性等弊端。本實(shí)驗(yàn)主要研究來(lái)源于經(jīng)血的經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells。MenSCs)在體外獲取及培養(yǎng)增殖的方法并鑒

2、定，觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況等基本生物學(xué)特性以及體外誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞成脂細(xì)胞方向分化以及重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)體外誘導(dǎo)其向子宮內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細(xì)胞方向分化的可行性及不同濃度雌激素對(duì)分化結(jié)果的影響。為其在臨床中的應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)采用Ficoll密度梯度法從月經(jīng)第二天健康女性經(jīng)血中分離MenSCs,采用經(jīng)典的MTT法對(duì)體外擴(kuò)增的第一代、第二代細(xì)胞描繪生長(zhǎng)曲線，并通過(guò)傳代培養(yǎng)、體外擴(kuò)增,使用倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及在培養(yǎng)過(guò)程中

3、的動(dòng)態(tài)增殖變化。第二代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型的表達(dá)情況。取第二代 MenSCs,分成誘導(dǎo)組和對(duì)照組。分別按5×104/mL接種至明膠包被的6孔板中,24小時(shí)細(xì)胞貼壁后。誘導(dǎo)組培養(yǎng)液更換成干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+專(zhuān)用血清,成骨誘導(dǎo)液為：雙抗、200μmol/L抗壞血酸、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和0.1μmol/L地塞米松。對(duì)照組培養(yǎng)液換為L(zhǎng)-DMEM添加10％FBS,細(xì)胞置入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每?jī)?/p>

4、天換液1次,連續(xù)培養(yǎng)3周。分別在第1、2、3周結(jié)束誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，通過(guò)檢測(cè)ALP活性、膠原表達(dá)情況、以及鈣結(jié)節(jié)表達(dá)情況，觀察成骨誘導(dǎo)的效果；分組方法同上，取第2代MenSCs,按5×104/mL接種于被明膠包被的6孔板中,細(xì)胞過(guò)夜貼壁后誘導(dǎo)組更換為干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+專(zhuān)用血清,1×10-6mol/L地塞米松,10mol/L胰島素,0.5mmol/L IBMX,0.2mmol/L吲哚美辛,對(duì)照組培養(yǎng)液L-DMEM添加10% FBS,

5、細(xì)胞置入37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每?jī)商鞊Q液1次。分別在誘導(dǎo)2、3、4周結(jié)束時(shí),進(jìn)行油紅O染色，鏡下觀察油紅染色的結(jié)果。通過(guò)檢測(cè)MenSCs成骨成脂的誘導(dǎo)情況。探討其在體外向成骨成脂方向分化的潛能。將培養(yǎng)后的MenSCs分為4個(gè)研究組，每組培養(yǎng)體系中添加生長(zhǎng)因子(TGF-β10ng/ml。EGF10ng/ml。PDGF-BB10ng/ml)和不同濃度17-β-雌二醇(1×10-9 mol/L、1×10-8 mol/L、1

6、×10-7 mol/L、1×10-6mol/L),分別標(biāo)記為組1、組2、組3、組4，培養(yǎng)體系中未添加生長(zhǎng)因子和雌激素的組為對(duì)照組。誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞標(biāo)記物角蛋白（cytokeratin，CK）和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物波形蛋白（Vimentin，VIM），同時(shí)運(yùn)用RT-PCR和Westernblot檢測(cè)CK、VIM mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)的量，以進(jìn)一步驗(yàn)證MenSCs是否向子宮內(nèi)膜方向分

7、化及不同雌激素濃度對(duì)分化過(guò)程的影響。
　　結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)表明利用 Ficoll離心法能從健康女性月經(jīng)血中分離并培養(yǎng)出干細(xì)胞，此原代細(xì)胞約1.5周達(dá)到85%~90%融合，細(xì)胞多成梭形、漩渦狀、輻射狀。MTT法得出細(xì)胞倍增時(shí)間約為30~32h。此細(xì)胞傳代后能穩(wěn)定生長(zhǎng)，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)以纖維樣為主導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)傳代中，在接種細(xì)胞1~2天，細(xì)胞增殖緩慢，第3~4天全量換液后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接著5-6天后細(xì)胞生長(zhǎng)較前緩慢，進(jìn)入平臺(tái)期，整個(gè)

8、過(guò)程未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。用流式細(xì)胞儀術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，此類(lèi)細(xì)胞表面標(biāo)記OCT-4、Strol-1、CD45、表達(dá)率分別為95.13%±0.81%，1.80%±0.92%，0.93%±0.42%。細(xì)胞表現(xiàn)出OCT-4強(qiáng)陽(yáng)性，Strol-1、CD45陰性。此說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞性質(zhì)。誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)表明MenSCs成骨誘導(dǎo)前期誘導(dǎo)組細(xì)胞膠原表達(dá)量較后期升高,MenSCs誘導(dǎo)兩周后經(jīng)茜素紅染色可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)明顯,誘導(dǎo)組細(xì)胞ALP(alkaline

9、phosphatase)活性-成骨細(xì)胞分化成熟的重要標(biāo)志隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，強(qiáng)陽(yáng)性，對(duì)照組陰性。經(jīng)成脂誘導(dǎo)3周,有明顯的脂滴出現(xiàn)，油紅O染色呈陽(yáng)性，對(duì)照組陰性。體外向子宮內(nèi)膜細(xì)胞方向分化結(jié)果表明：各研究組 CK、VIM mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（p<0.05)；組2（1×10-8mol/L）CK mRNA表達(dá)水平最高與其他4組相比較(p<0.05，)，且CK mRNA表達(dá)量隨雌激素濃度增高略有下降；而VIM的m

10、RNA表達(dá)量相反，即隨著雌激素濃度增高 VIM mRNA表達(dá)的量增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CK和 VIM蛋白相對(duì)表達(dá)量也顯示這一結(jié)果。證實(shí)MenSCs在體外細(xì)胞生長(zhǎng)因子和雌激素刺激下能夠向子宮內(nèi)膜細(xì)胞方向分化，且雌激素濃度不同分化結(jié)果有差異。
　　結(jié)論:通過(guò)Ficoll密度梯度離心法能獲得MenSCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)特定的細(xì)胞表面標(biāo)志物也證實(shí)了其為經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細(xì)胞，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)也表明其能在體外誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞方向分化