表皮干細(xì)胞多向分化潛能特征的發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)研究.pdf

1、目的：⑴探討表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells,ESCs)潛在亞群及分析其解剖分布特點(diǎn)；⑵建立ESCs轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)方法,拓展ESCs多向分化潛能；⑶明確ESCs體外培養(yǎng)表達(dá)譜特征,初步建立ESCs非轉(zhuǎn)基因重編程為誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)實(shí)驗(yàn)體系。
　　 方法：①應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)不同解剖部位皮膚組織CD34的表達(dá)。利用RT-PCR技術(shù)及

2、免疫熒光染色技術(shù),從mRNA及蛋白水平檢測(cè)包皮來(lái)源表皮基底層細(xì)胞CD34分子表達(dá)情況,并從蛋白水平研究ESC特異性標(biāo)記β1整合素,p63與CD34雙標(biāo)記的情況。將標(biāo)本按照年齡分組,應(yīng)用流氏比較不同年齡組CD34各表位表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②采用經(jīng)典方法富集包皮來(lái)源未分化角質(zhì)細(xì)胞(undifferentiatied keratinocytes,UKs),通過(guò)流氏及免疫熒光方法檢測(cè)UKs特異性標(biāo)記,評(píng)價(jià)Epilife培養(yǎng)體系對(duì)UKs的生長(zhǎng)增殖作

3、用,并通過(guò)檢測(cè)fibroenctin,nestin,c-kit排除可能的其他種類(lèi)細(xì)胞的污染,保證UKs純度。UKs生長(zhǎng)到密度為80％-95％時(shí)做為誘導(dǎo)初始細(xì)胞,分別采用直接血清誘導(dǎo)法、直接定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)法和馴化誘導(dǎo)法進(jìn)行誘導(dǎo)。檢測(cè)成脂相關(guān)mRNA及油紅O染色證實(shí)脂肪系列轉(zhuǎn)分化,檢測(cè)成肌相關(guān)mRNA及SMA免疫熒光染色證實(shí)肌肉系列轉(zhuǎn)分化,檢測(cè)成神經(jīng)相關(guān)mRNA水平及nestin,β3-tubulin,GFAP免疫熒光染色證實(shí)神經(jīng)系列轉(zhuǎn)

4、分化。血清誘導(dǎo)包皮來(lái)源皮膚組織全層碎塊,模擬創(chuàng)傷局部血清滲出條件,免疫熒光檢測(cè)角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型轉(zhuǎn)變。建立小鼠損傷模型,選取不同時(shí)間點(diǎn)利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)創(chuàng)傷局部角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞類(lèi)型轉(zhuǎn)變。③mRNA水平檢測(cè)體外培養(yǎng)ESCs表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)變化特征(特別是多潛能轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)鍵性調(diào)控分子)。通過(guò)轉(zhuǎn)染OCT4,SOX2,KLF4,c-Myc轉(zhuǎn)基因手段重編程ESCs,或是體外通過(guò)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境直接誘導(dǎo)ESCs去分化,均通過(guò)堿性磷酸酶染色及免疫熒光方法

5、檢測(cè)多潛能轉(zhuǎn)錄分子OCT4,SSEA1,NANOG驗(yàn)證iPSCs的產(chǎn)生,將獲得iPSCs樣克隆進(jìn)行擬胚體實(shí)驗(yàn),以證實(shí)誘導(dǎo)的iPSCs的多能性。
　　 結(jié)果：⑴CD34分子三種表位在人的頭皮及包皮有所表達(dá),但是在軀干皮中未檢測(cè)到。這體現(xiàn)CD34分子在不同解剖部位的非均衡性分布。CD34陽(yáng)性細(xì)胞多位于表皮突底部,這是ESCs的居所。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)包皮分離表皮基底層細(xì)胞中β1整合素及p63陽(yáng)性細(xì)胞要多于CD34表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞,并且CD

6、34表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)β1整合素和p63。β1整合素,p63及CD34陽(yáng)性細(xì)胞均隨傳代,陽(yáng)性表達(dá)率呈現(xiàn)下降趨勢(shì).體外培養(yǎng)第6代時(shí),CD34陽(yáng)性細(xì)胞完全消失,只存在少量的β1整合素和p63陽(yáng)性細(xì)胞.另外.我們發(fā)現(xiàn)CD34陽(yáng)性細(xì)胞并不隨著供體年齡的增加出現(xiàn)顯著性變化。⑵應(yīng)用體外細(xì)胞馴化誘導(dǎo)策略,能夠?qū)崿F(xiàn)UKs多向分化.包皮來(lái)源Uks在Eplife培養(yǎng)體系中處于高增殖、不分化狀態(tài).研究發(fā)現(xiàn),UKs直接置于血清或是定向分化培養(yǎng)基中,UKs只是

7、定向分化為表皮細(xì)胞。然而,血清按照一定的比例逐漸增量加入到Eplife培養(yǎng)體系中,即血清馴化誘導(dǎo),可以在3周之內(nèi)將UKs非定向轉(zhuǎn)分化為平滑肌細(xì)胞、肌成纖維母細(xì)胞及少量的脂肪細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞。相比之下,系列定向分化培養(yǎng)基與Eplife的聯(lián)合馴化誘導(dǎo)方案,能夠?qū)Ks定向分化為神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或是肌肉細(xì)胞.血清漂養(yǎng)包皮組織48小時(shí)(hrs),包皮表皮角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為vimentin,FSP陽(yáng)性細(xì)胞.單純包皮表皮漂養(yǎng)48hrs,表皮基底層細(xì)胞

8、能夠轉(zhuǎn)分化為SMA陽(yáng)性細(xì)胞.小鼠體內(nèi)模型動(dòng)態(tài)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中創(chuàng)緣角質(zhì)細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)分化為vimentin,FSP陽(yáng)性細(xì)胞,但是始終未見(jiàn)SMA陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)。⑶體外培養(yǎng)的ESCs確實(shí)存在多潛能轉(zhuǎn)錄分子OCT4,SOX2,KLF4,c-Myc,NANOG的滲漏表達(dá),這些分子一致性的在3-5天(d)時(shí)達(dá)到高峰,這與iPSC產(chǎn)生理論之一——精錄噪聲的理論相一致.流氏檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)3d的ESCs中確實(shí)存在OCT4表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞,這進(jìn)一步證實(shí)了

9、iPSC產(chǎn)生原理的另外一個(gè)理論——精英細(xì)胞學(xué)說(shuō)。選用體外培養(yǎng)3-5d的ESCs進(jìn)行轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因重編程,進(jìn)入胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境持續(xù)觀(guān)察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因重編程在體外誘導(dǎo)6d時(shí),出現(xiàn)iPSCs樣克隆,非轉(zhuǎn)基因重編程在體外誘導(dǎo)14d時(shí),能夠觀(guān)察到iPSC樣克隆,免疫熒光結(jié)果顯示這些克隆表達(dá)多潛能轉(zhuǎn)錄分子OCT4,SSEA1,NANOG,同時(shí)表達(dá)ESCs特異性標(biāo)記CD29。堿性磷酸酶染色對(duì)2種方法重編程的效率進(jìn)行比較,轉(zhuǎn)基因明顯高于非轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基

10、因?yàn)?.3％,非轉(zhuǎn)基因?yàn)?.00002-0.00015％。另外,體外iPSCs樣克隆能夠形成擬胚體,提示其具有發(fā)育能力。
　　 結(jié)論：①系統(tǒng)性的研究CD34三種表位在不同解剖部位的表達(dá)情況,初步顯示CD34可能在頭皮及包皮組織中代表了ESCs的一個(gè)亞群,并且CD34在不同解剖部位存在不均衡性進(jìn)一步證實(shí)了干細(xì)胞異質(zhì)性的特征。②研究數(shù)據(jù)顯示人的UKs在體外具有多向分化能力.另外,通過(guò)小鼠的創(chuàng)傷模型也證實(shí)在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中存在角質(zhì)細(xì)胞向